Les spermatozoïdes sont les cellules les plus utilisées pour la cryoconservation des ressources génétiques en aquaculture. Il est connu que les spermatozoïdes de poissons transmettent aux embryons non seulement leur patrimoine génétique, mais aussi leur profil épigénétique notamment la méthylation de l’ADN. Ainsi, toute altération du profil de méthylation de l’ADN des spermatozoïdes induit un risque de transmission d’altérations épigénétiques à la descendance. L’objectif de cette étude est d’évaluer si la cryoconservation du sperme peut modifier le profil de méthylation de l’ADN du spermatozoïde chez la truite arc-en-ciel. Sa finalité est de connaitre le risque de l’utilisation de sperme cryoconservé pour la descendance. Pour induire des réponses cellulaires variables après la cryoconservation, les spermatozoïdes ont été cryoconservés dans différents cryoprotecteurs : le diméthyl sulfoxyde, le méthanol, et le glycérol. Nous avons confirmé que chacun d’eux apportait un niveau de protection cellulaires différent selon le critère étudié (qualité des membranes et des mitochondries, motilité, fécondance). Suite à l’analyse de la méthylation de l’ADN par RRBS, nous n’avons pas vu d’effet global de la cryoconservation. Au niveau du génome, nous avons pu identifier un faible nombre (335 à 564) de cytosines à statut différentiellement méthylé (DMCs). Peu sont communes entre les cryoprotecteurs, et aucune corrélation n’a été observée entre le nombre de DMCs et les altérations cellulaires post-cryoconservation. Nous suggérons cependant que les DMCs signent l’existence de régions potentiellement sensibles à la cryoconservation. En conclusion, la méthylation de l’ADN des spermatozoïdes de truite arc-en-ciel ne serait que faiblement sensible à la cryoconservation. Les régions affectées nécessitent confimation avant d’étudier l’effet sur la descendance.

Les mutations du gène AUTS2 humain ont été associé à de nombreuses neuropathologies tels que des troubles du spectre autistique, un retard global de développement associé à une déficience intellectuelle, des troubles de l’hyperactivité ou encore de la schizophrénie. Ce gène fortement conservé au cours de l’évolution des vertébrés, est un régulateur majeur du développement du système nerveux central. Que ce soit par des rôles de facteur de transcription, de régulation du métabolisme de l’ARN ou de mise en place du cytosquelette d’actine. L’importance de sa contribution maternelle n’a cependant pas été caractérisée. Dans cette thèse, nous retraçons dans un premier temps l’histoire évolutive de ce gène présentant deux copies (auts2a et auts2b) chez certains poissons téléostéens. Nous cherchons également à caractériser l’impact de la contribution maternelle d’auts2a chez les poissons en générant, par la technique de CRISPR/Cas9, des lignées de médakas (Oryzias latipes) présentant des mutations dans diverses partie du gène. Nous démontrons ici que l’expression d’auts2a dans l’ovocyte régule l’expression de facteurs maternels qui vont eux même réguler l’expression de gènes nécessaires au développement du système nerveux au cours du développement embryonnaire précoce. L’absence de contribution maternelle d’auts2a se traduit également par des phénotypes macroscopiques et comportementaux atypiques chez les individus adultes. Ce travail apporte de nouvelles perspectives sur l’importance et les mécanismes du déterminisme intergénérationnel du neurodéveloppement et du comportement.

L'ovaire est caractérisé par des processus de croissance, de stockage et de recrutement des ovocytes entraînant d'importants réarrangements cellulaires au cours du cycle de vie de la femelle. Chez le médaka Oryzias latipes, comme chez d'autres poissons téléostéens, ces mécanismes d'ovogenèse sont mal compris d'un point de vue quantitatif et restent souvent extrapolés à partir de fractions de l'organe entier. Par conséquent, la connaissance de la dynamique des populations d'ovocytes dans l'ovaire est limitée, alors qu'elle est essentielle pour comprendre la régulation de la fertilité, notamment chez les espèces à intervalles de ponte courts comme le médaka. Pour y remédier, nous avons développé une méthode d'analyse des ovaires entiers qui est exhaustive, accessible et également transférable à d'autres espèces. En combinant la transparisation des tissus, la microscopie confocale 3D et l'analyse d'images assistée par des algorithmes d'apprentissage profond, notre méthode a permis d'extraire des données quantitatives et morphologiques à différents stades de développement. L'analyse de l'évolution du contenu ovarien au cours du temps a révélé l'établissement de différentes réserves folliculaires au cours de la croissance/maturation de la femelle, indiquant la présence de deux recrutements majeurs qui alimentent progressivement une distribution folliculaire asynchrone chez l'adulte reproducteur. L'étude de la lignée miR-202-KO, dont la fertilité est réduite, a mis en évidence l'importance du maintien de la distribution asynchrone des follicules pour l'établissement d'un taux de fertilité normal. Les dérégulations des profils de distribution des follicules observées chez les femelles miR-202-KO sont cohérentes avec le rôle de miR- 202 dans la régulation du recrutement des follicules au milieu et à la fin de la croissance primaire. Grâce au développement de méthodes innovantes, cette étude a ainsi permis de mieux comprendre la dynamique ovarienne chez les poissons, ainsi que la manière dont miR-202 est impliqué dans sa régulation.

L’évolution des mécanismes de détermination du sexe (SD), qui a souvent été abordée principalement dans un contexte macro-évolutif chez les poissons, montre une variabilité saisissante des gènes SD et de leurs chromosomes sexuels associés. En plus des chromosomes de type A, certaines espèces de poissons téléostéens contiennent des chromosomes B (Bs), qui sont parfois considérés comme des chromosomes sexuels. À ce titre, mon projet de thèse avait pour objectif d’explorer l’évolution des systèmes SD en lien avec les Bs chez le tétra Mexicain, Astyanax mexicanus, qui comporte de nombreuses populations cavernicoles (CF) ayant évoluées à partir d'une population ancestrale de surface (SF) il y a moins de 20 000 ans. Nos travaux apportent des preuves fonctionnelles de l’existence d’un système de SD “original” reposant uniquement sur des chromosomes “B-sexuels” à dominance mâle avec gdf6b-B comme potentiel gène déterminant majeur du sexe chez les CF de la grotte Pachón. En parallèle, nous apportons des résultats qui suggèrent qu’il pourrait exister une transition évolutive rapide entre un système de type B-sex chromosome à dominance mâle fixe chez certaines populations vers un système plus complexe (probablement polygénique) ne reposant que partiellement sur le chromosome “B-sexuel” et ses loci gdf6b-B chez d’autres populations.

Les microARNs (miARNs), petits ARNs non codants, sont des fins régulateurs de l’expression des gènes. Les miARNs jouent des rôles essentiels dans les processus biologiques physiologiques mais aussi pathologiques. Cependant, leurs rôles durant l’ovogenèse chez les vertébrés demeurent peu documentés. D’une manière similaire aux gènes ovocytes-spécifiques, nous avons proposé l’hypothèse que les miARNs ovaire-prédominants joueraient des rôles essentiels durant l’ovogenèse et/ou le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ma thèse était, dans un premier temps, d’identifier les miARNs ovaire-prédominants chez le médaka (Oryzias latipes). Ensuite, dans un deuxième temps, de caractériser le rôle de MiR202, un miARN gonades-prédominant chez les vertébrés. Par une analyse transcriptionnelle à grande échelle, nous avons identifié 66 miARNs ovaire-prédominants chez le médaka, qui, pour la plupart, n’ont jamais été identifiés ni chez le poisson ni dans l’ovaire. Neuf d’entre eux ont été validés par PCRq. Parmi ces derniers, 3 miARNs (MiR4785, MiR6352 et MiR729) présentent une expression ovarienne stricte. De plus, nous avons mis en évidence une isoforme de MiR202 qui est ovaire-prédominante. L’analyse de l’expression de MiR202 durant l’ovogenèse et le développement embryonnaire a montré une expression de ce dernier durant tous les stades de l’ovogenèse. Cependant, il n’est détecté que durant les premiers stades de développement embryonnaire, précédent l’activation du génome zygotique, en cohérence avec un potentiel effet maternel. Afin de caractériser la fonction de MiR202, nous avons réalisé une inactivation fonctionnelle de ce dernier chez le médaka par le système CRISPR/Cas9. La déplétion de mir202 a causé une baisse de fécondité et un arrêt du développement avant le stade une cellule. Une analyse transcriptionnelle globale des ovaires mir202-/-, nous a permis d’identifier plusieurs gènes modulés par MiR202. Parmi eux, six3, cible potentielle de MiR202, semble réguler plusieurs gènes essentiels durant l’ovogenèse ou le développement embryonnaire. Ces travaux nous ont permis d’identifier plusieurs miARNs ovaire-prédominants. Parmi eux, nous avons montré que MiR202 joue un rôle essentiel durant l’ovogenèse et sa contribution en tant que gène à effet maternel est indispensable au développement embryonnaire précoce chez le médaka.

Les cellules souches spermatogoniales (SSCs) constituent la population de cellules germinales initiales support de la production des spermatozoïdes tout le long de la vie d’un individu. Ces cellules caractérisées par leur capacité d’auto-renouvellement et de différenciation maintiennent ainsi une réserve et garantissent la production continue de cellules germinales différenciées. Chez les mammifères, plusieurs marqueurs permettant de reconnaitre cette population cellulaire au sein du testicule ont été identifiés. De plus, parmi ces marqueurs, certains permettent d’isoler et de purifier les SSCs. Ils ont ainsi permis d’aborder les mécanismes de régulation du devenir des SSCs par des expériences menées in vitro et in vivo. En revanche, la biologie de ces cellules est beaucoup moins connue chez les vertébrés non mammaliens, en particulier chez les poissons téléostéens. Notre modèle d’étude, la truite arc-en-ciel (Oncorynchus mykiss) est caractérisée par une spermatogenèse cyclique et fortement saisonnée. La croissance du testicule immature, la prolifération active des spermatogonies à la puberté, et la quiescence de ces dernières en fin de cycle semblent être des étapes clés de régulation du devenir des SSCs. Grâce à l’analyse des profils d’expression au cours du cycle spermatogénétique et dans des fractions de cellules testiculaires isolées, nous montrons la conservation d’expression de gènes décrit comme marqueurs de SSCs chez les mammifères (pou2, plzf, nanos2 et 3, gfra1) dans les populations de spermatogonies A indifférenciées de truite. En particulier, gfra1 et nanos2 identifient tous deux une sous-population de cellules au sein des spermatogonies. Nous proposons donc que les cellules gfra1+ et/ou nanos2+ sont des SSCs au sein du testicule de truite. Par ailleurs, nous montrons que l’orthologue truite de gdnf, ligand de gfra1 et régulateur majeur du maintien des SSCs chez la souris, est exprimé très fortement juste avant la fin de cycle spermatogénétique. Cette expression corrélée avec un pic de sécrétion plasmatique de Fsh suggérait une régulation positive de gdnf par cette hormone. Notre étude in vitro n’a pas permis d’aboutir aux mêmes conclusions, mais cette technique ne reflète pas toutes les régulations réciproques ni le rôle des autres facteurs in vivo. En conclusion, nous avons découvert des marqueurs probables de SSCs chez la truite. En particulier, gfra1 et nanos2 qui permettront une analyse plus approfondie de la biologie des SSCs chez les téléostéens. De plus, l’expression de gdnf et de son récepteur dans le testicule, régulée en fonction du stade du cycle spermatogénétique, nous permet d’envisager cette voie comme régulateur du devenir des SSCs chez la truite.

La truite arc-en-ciel a un déterminisme du sexe strictement génétique de type XX/XY. Pourtant des femelles génétiques se sont spontanément masculinisées après une gynogénèse endomitotique. Ce phénotype masculinisé à pénétrance incomplète serait dû à une mutation inconnue appelée « mal ». Afin d'identifier le gène causal porteur de cette mutation, une meilleure caractérisation de son phénotype est nécessaire. Pour cela, nous avons procédé à la caractérisation du phénotype gonadique en utilisant à la fois des approches histologiques et moléculaires. Tous les animaux XXmal présentent une différenciation sexuelle très perturbée autant sur le plan histologique que sur le plan de leurs profils d'expression géniques. Parmi ces perturbations, l'inhibition de l'expression du gène de l'aromatase gonadique (cyp19a1a), une enzyme de synthèse des œstrogènes, pourrait être un facteur explicatif de cette masculinisation. De plus des températures d'élevage élevées (18°C) augmentent fortement la masculinisation de ces animaux XXmal. Enfin, la croissance des animaux XXmal est affectée négativement selon le degré de perturbation. En conséquence, la masculinisation de ces animaux serait le résultat d'une dérégulation profonde en amont du gène cyp19a1a, avec comme conséquence une instabilité précoce de la différenciation ovarienne suivie par la masculinisation effective d'une partie des animaux XXmal. Cette instabilité serait amplifiée par des températures élevées qui affecteraient à la fois le développement global des animaux XXmal et la transcription de cyp19a1a. Nos résultats suggèrent fortement que le phénotype "mal" est plus complexe qu'un simple phénotype "femelle masculinisée".