Staphylococcus aureus est une bactérie pathogène redoutable, dotée d'une remarquable capacité d'adaptation. Grâce à une régulation génique complexe, cette bactérie déploie de nombreux mécanismes pour survivre aux conditions stressantes. Les ARN régulateurs (ARNrég) figurent parmi les acteurs de cette réponse adaptative, modulant l'expression de leurs cibles au niveau post-transcriptionnel et contribuant ainsi à une réponse rapide et ciblée. Parmi les ARNrég identifiés chez S. aureus, certains se distinguent par leur sensibilité environnementale, étant exprimés en réponse à des conditions spécifiques. Ce travail s’est focalisé sur la caractérisation de RsaOI, un ARNrég issu d’un environnement génétique fortement sollicité lors de stress environnementaux variés. RsaOI est induit dans des conditions de stress affectant la paroi, dont l’acidification et l’exposition aux glycopeptides. Son accumulation est dépendante du système à deux composants VraSR, connu pour son rôle majeur dans la réponse aux antibiotiques ciblant la paroi. L’étude des cibles de RsaOI, réalisée grâce à des approches omiques et la méthode MAPS, a révélé son implication dans des processus essentiels : la réparation de l'ADN, la dynamique de la paroi, ainsi que le métabolisme. Parmi ces cibles figure l’opéron lac, impliqué dans la métabolisation du galactose et dont l'activité influence la structure du peptidoglycane. Dans ce travail, RsaOI apparait comme un médiateur agissant à l'interface entre la réponse au stress de la paroi et la régulation métabolique.

Staphylococcus aureus est une bactérie commensale et pathogène responsable d’un large spectre d’infections. Pour permettre une adaptation rapide et efficace aux signaux environnementaux, S. aureus possède un réseau de régulation précis et complexe. Dans ce réseau, les ARN régulateurs (ARNreg) apparaissent comme des modulateurs post-transcriptionnels importants. Les ARNreg sont généralement définis comme des ARN non codants, petits, stables, avec des fonctions de régulation sur leurs cibles. À ce jour, environ 200 ARNreg ont été identifiés chez S. aureus. Dans ce travail, nous avons étudié l’un d’eux : Srn_9342. Cet ARNreg est transcrit sous deux formes – une courte (Srn_9342S) et une longue (Srn_9342L) – partageant la même extrémité 5’ et dont l’annotation chevauche avec la séquence codante située en amont. Il s’agissait ainsi de caractériser l’expression du gène srn_9342, d’identifier ces cibles et de définir sa fonction biologique. Un profil d'expression spécifique a été observé, avec une permutation de Srn_9342S vers Srn_9342L en fonction de la densité cellulaire. La découverte d’un promoteur spécifique pour srn_9342 a révélé qu’il s’agit du premier cas d’ARNreg dérivé d’une région 3’ UTR d’ARNm de type I identifié chez S. aureus. De plus, nous avons montré que l’expression de Srn_9342L est dépendante de SigB L’identification de ces cibles ARN par MAPS, a identifié l’ARNm hemQ, codant une coproporphyrine décarboxylase impliquée dans la biosynthèse de l'hème, et l’ARNIII, un ARNreg central de la virulence, comme cibles directes de Srn_9342. Enfin, les rôles de cet ARNreg dans la régulation de la biosynthèse de l'hème, la formation du phénotype SCV et la virulence ont été démontrés.

Les bactéries au métabolisme ralenti (tolérantes et persistantes) sont capables de survivre aux antibiotiques ce qui contribue à l’échec des traitements et à la rechute des infections. Les systèmes toxine-antitoxine (TA) font partie des mécanismes participant à la formation des bactéries tolérantes/persistantes. Chez Staphylococcus aureus, un pathogène humain majeur, l’antitoxine ARN SprF1 appartenant au système TA de type I SprG1/SprF1, peut se fixer sur les ribosomes ce qui entraine une atténuation de la traduction et favorise la formation des bactéries persistantes. Afin de mieux comprendre le rôle de SprF1 dans l’adaptation de S. aureus aux antibiotiques, nous nous sommes intéressés à l’étude de la régulation du système SprG1/SprF1 et à l’identification du targetome de SprF1. Par des approches in silico et par la technique MAPS (MS2 Affinity Purification coupled with RNA Sequencing), nous avons mis en évidence 12 cibles ARNm de SprF1, dont l’ARNm sprG1. Nous avons ensuite démontré que SprF1 interagi, in vitro, avec les ARNm yidC et rpmE2, le premier codant une protéine insertase et le second la protéine ribosomale L31, et que cette interaction entraîne une modulation de l’expression des protéines YidC et RpmE2. Par la suite, nous avons observé que la surexpression de rpmE2 favorise la tolérance aux antibiotiques ce qui pourrait contribuer au phénotype de persistance induit par SprF1. Les résultats présentés dans ce travail de thèse montrent donc que certaines antitoxines de type I agissent comme des ARN régulateurs typiques qui, en interagissant avec plusieurs cibles, ont un rôle dans l’adaptation des bactéries à leur environnement.

L'objectif de la thèse était d'évaluer le potentiel thérapeutique d'un nouveau pseudopeptide antimicrobien, nommé Pep16, à la fois in vitro et in vivo pour le traitement de l'arthrite septique causée par Staphylococcus aureus. Sept isolats cliniques de S. aureus (dont 1 SARM et 5 SASM) ont été étudiés. Les CMI de Pep16 et des comparateurs (vancomycine, teicoplanine, daptomycine et lévofloxacine) ont été déterminées par la méthode de microdilution en bouillon. L'activité intracellulaire de Pep16 et de la lévofloxacine a été évaluée en utilisant deux modèles d'infection, avec des cellules phagocytaires non-professionnelles (ostéoblastes MG-63) ou professionnelles (macrophages THP-1). L'impact de Pep16 sur la dynamique de croissance du biofilm a été évalué. Un modèle murin d'arthrite septique a été utilisé pour évaluer l'efficacité in vivo de Pep16. Une analyse PK préliminaire a été effectuée en mesurant la concentration plasmatique par LC-MS/MS après une seule injection sous-cutanée de Pep16. Les CMI de Pep16 étaient de 8 mg/L pour tous les isolats cliniques de S. Aureus (de 2 à 32 fois supérieures à celles des comparateurs) tandis que les ratios CMB/CMI confirmaient une activité bactéricide. Tant Pep16 que la lévofloxacine (à 2 x CMI) ont réduit de manière significative la charge bactérienne de tous les isolats testés (2 SASM et 2 SARM) à la fois dans les ostéoblastes et les macrophages. Pep16 a réduit de manière significative les charges bactériennes dans les articulations des genoux des souris infectées par SASM. L'analyse PK après une seule administration sous-cutanée de Pep16 (10 mg/kg) a montré une augmentation lente des concentrations plasmatiques jusqu'à 12 heures (Cmax à 5,6 mg/L).

Le suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des bêta-lactamines permet l’individualisation de la prise en charge d'infections profondes comme l’endocardite infectieuse (EI). La faible diffusion supposée au site infectieux, à savoir les valves cardiaques, est un des éléments qui justifie leur administration à forte dose par voie intra-veineuse. Ainsi, les patients atteints d’EI se voient donc exposés à de fortes concentrations bêta-lactamines pendant 2 à 6 semaines. Dans ce contexte, la survenue d’une neurotoxicité ou d’une néphrotoxicité aux bêta-lactamines peut être lourde de conséquences. Or il existe peu de données de diffusion des bêta-lactamines dans les valves cardiaques et le lien concentration-neurotoxicité des bêta-lactamines est mal documenté en particulier pour l’amoxicilline. Enfin, dans un contexte d’augmentation de l’incidence des EI staphylococciques, la réponse microbiologique aux antibiotiques dans la prise en charge de l’EI à S. aureus est elle-même mal décrite et nécessite d’être évaluée en condition biofilm. Ainsi, la première partie de ce travail a permis d’identifier un seuil de concentrations neurotoxiques en amoxicilline par l’exploitation d’un entrepôt de données intra-hospitalières. La deuxième partie du travail a permis de caractériser au sein d’un essai prospectif une diffusion conséquente des bêta-lactamines au sein des valves cardiaques, en particulier de l’amoxicilline avec un ratio diffusion médian plasma:valve de 62%. Enfin la mise au point d’un modèle ex vivo d’EI à S. aureus sur valves humaines a permis la comparaison de l’activité anti-biofilm de la vancomycine,et d’un lipoglycopeptide; la dalbavancine et d’identifier une activité éradicatrice du biofilm marquée pour cette dernière, fournissant un élément supplémentaire de l’acitivé de la dalbavancine dans l’EI. L’ensemble de ces données a permis d’affiner la fenêtre thérapeutique des anti-infectieux indiqués dans la prise en charge de l’endocardite.

Enterococcus faecium et Staphylococcus aureus sont des bactéries pathogènes opportunistes de l’homme responsables d’épidémies hospitalières. Les antiseptiques sont très utilisés pour prévenir la survenue de ces infections et leur présence dans l’environnement hospitalier, même à faibles concentrations, dites subinhibitrices, constitue un stress auquel ces bactéries doivent d’adapter. Les ARN régulateurs (sARN) sont des acteurs importants pour l’adaptation aux variations environnementales des bactéries. Les preuves de leur existence sont anciennes chez S. aureus mais récentes chez E. faecium, entrainant un état des connaissances très hétérogène. Dans un premier temps, nous avons souhaité caractériser les sARN dont l’expression était altérée en cas de stress antiseptique exercé par de la chlorhexidine, du chlorure de benzalkonium, de la povidone iodée et du triclosan. Nous avons montré que ce stress entrainait une répression globale des sARN étudiés chez E. faecium mais pas chez S. aureus. Dans un second temps, l’étude approfondie d’un sARN d’E. faecium sélectionné, l’Ern0160, a permis de mettre en évidence la toute première cible directe d’un sARN de E. faecium. En effet, l’Ern0160 se lie spécifiquement à un ARN messager dont la protéine correspondante serait impliquée dans la virulence d’après un modèle expérimental murin. L’Ern0160 régule négativement l’expression de sa cible in vitro. L’impact de l’Ern0160 sur l’atténuation de la virulence de E. faecium reste à évaluer in vivo afin d’avoir une vision globale de son rôle dans la pathogénicité de ce dernier.

Staphylococcus aureus est un pathogène opportuniste de l’Homme. La régulation de sa virulence est assurée par l’action coordonnée de facteurs de transcription comme SarA et d’ARN régulateurs. SarA est un régulateur majeur, impliqué dans la formation de biofilm, la résistance aux antibiotiques et l’expression de facteurs de virulence. La détermination de l’ensemble des cibles régulées par SarA présentée dans cette étude permettra de mieux appréhender les réseaux de régulation chez S. aureus. La combinaison d’analyses transcriptomiques (RNA-Seq), de ChIP-Seq et de bio-informatique a mis en évidence 140 gènes régulés par SarA. La régulation transcriptionnelle directe de 9 gènes codant des protéines, et 7 gènes exprimant un sARN a été validée expérimentalement (un sARN se définissant comme un potentiel ARN régulateur). SarA réprime l’expression d’une toxine (sprG2) et d’une antitoxine (sprA2AS) appartenant à deux systèmes toxine-antitoxine de type I distincts. Par ailleurs, l’analyse comparative entre les cibles sARN de SarA et celles publiées pour le facteur de transcription CodY révèle que les gènes sARN teg1, rsaOB, rsaD et teg16 seraient régulés par CodY et SarA de manière coordonnée au cours de la croissance. Ces sARN sont connus ou prédits pour être impliqués dans la synthèse d’acides aminés (méthionine et acides aminés branchés) chez S. aureus. De plus, Teg16 et RsaD semblent partager des fonctions métaboliques communes puisque chacun régule la production d’une acétolactate synthase distincte. Ces travaux mettent en lumière les doubles régulations de gènes sARN par des facteurs de transcription, avec ici l’exemple de SarA et CodY chez S. aureus.

Enterococcus faecium est une bactérie commensale du tube digestif de l’homme, pathogène opportuniste multi-résistant aux antibiotiques et responsable d’épidémies hospitalières. L’existence d’ARN régulateurs chez E. faecium (Ern) ayant récemment été découverte, ce travail de thèse avait pour objectif d’évaluer leur implication in vivo. Un modèle de colonisation a été mis au point chez la souris, à partir de plusieurs modèles décrits dans la littérature. Ils ont été comparés, et un nouveau modèle associant la ceftriaxone et l’amoxicilline a été développé. L’ARN régulateur Ern0160 a ensuite été étudié. Quatre souches d’E. faecium ont été utilisées, Aus0004 (WT), la souche mutante WT délétée d‘ern0160 (Δ0160), la souche Δ0160 trans-complémentée surexprimant ern0160 (Δ0160_0160), et la souche Δ0160 contenant le vecteur pAT29 vide (Δ0160_pAT29). Dans les expériences in vitro, aucune différence n'a été observée entre les souches WT et Δ0160 cultivées seules, tandis que la souche Δ0160_0160 s'est développée plus lentement que Δ0160_pAT29. In vivo, aucune différence significative de colonisation n’a été observée avec les souches inoculées seules. Dans les essais de compétition in vitro et in vivo, la souche WT était prédominante par rapport à la souche délétée Δ0160. Avec la suspension « Δ0160_0160 + Δ0160_pAT29 », la souche Δ0160_pAT29 était prédominante, suggérant un effet délétère de la surexpression d’ern016. Ces résultats suggèrent l'implication d'Ern0160 dans la colonisation intestinale par E. faecium. Des modèles d’infection (endocardite infectieuse et bactériémie secondaire à une translocation intestinale) ont été développés au cours de ce travail mais restent à finaliser.

Enterococcus faecium est un pathogène opportuniste multi-résistant aux antibiotiques, adapté à l’environnement hospitalier et responsable de nombreuses épidémies hospitalières. L’étude de la réponse au stress antibiotique a récemment permis la mise en évidence des premiers petits ARN exprimés chez E. faecium. Ce travail de thèse s’inscrit dans la détermination des fonctions de certains de ces ARN, notamment en lien avec l’antibio-résistance. Nous avons pu identifier ces ARN soit comme des régulateurs localisés dans la région 5’ non traduite (5’UTR) du gène régulé soit comme des ARN régulateurs bona fide. Une investigation fonctionnelle de deux de ces régulateurs situés en 5’UTR a été effectuée par des approches génétiques, transcriptomiques et phénotypiques. Le premier, ern0030, est impliqué dans la régulation du gène de résistance aux tétracyclines tet(M). Nos travaux apportent de nouvelles données expérimentales suggérant l’existence d’un mécanisme de régulation alternatif à celui d’atténuation transcriptionnelle initialement décrit. Le second, ern2050, est un régulateur de type T-box riboswitch impliqué dans la régulation des deux aminoacyl-synthétases HisS et AspS. Nous avons validé expérimentalement ce premier T-box riboswitch chez E. faecium. Cette investigation a également permis de mettre en place un milieu chimiquement défini ayant permis la détermination des acides aminés essentiels chez l’espèce E. faecium et de décrire l’impact de l’absence de régulation de l’opéron hisS-aspS sur la croissance bactérienne dans un milieu pauvre en aspartate. Les données transcriptomiques obtenues ont permis de révéler un autre T-box riboswitch spécifique de l’ARNtHis, ern1900.

Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram positif fréquemment trouvée dans la flore commensale de la peau. Elle est capable de s’adapter aux changements environnementaux grâce à la reprogrammation rapide de l'expression génique modulée par des ARN régulateurs, parmi d’autres facteurs. Au cours de ma thèse, mes travaux ont porté sur un nouvel ARN régulateur, appelé SprY (alias S629), avec l’objectif de comprendre sa fonction biologique. Dans un premier temps, nous avons étudié le profil d'expression de l'ARN SprY au cours de la croissance bactérienne et dans des conditions de stress. Ensuite, nous avons identifié plusieurs cibles directes pour SprY par des prédictions in silico et in vivo par MAPS (MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach). Parmi toutes les cibles identifiées, nous nous sommes intéressés au gène SAOUHSC_03046 codant pour un régulateur transcriptionnel des protéines de la famille XRE, SAOUHCS_1342a codant pour la protéine des canaux mécanosensibles et RNAIII, qui est le riborégulateur principal de la virulence de S. aureus. Nous avons démontré que SprY interagit avec les ARNm de SAOUHSC_03046 et SAOUHSC_1342a au niveau de leur RBS (Ribosome Binding Site) et empêche l'initiation de la traduction de ces cibles. La caractérisation de l'interaction entre SprY et RNAIII a montré que SprY agit comme une éponge pour RNAIII et modifie la régulation de l'expression de plusieurs cibles de ce riborégulateur. SprY réduit également l'activité hémolytique de S. aureus pendant l'infection. L’ensemble de ces résultats ont montré que SprY joue le rôle d’éponge pour RNAIII et sa contribution dans la pathogénicité de S. aureus.