L'objectif de la thèse était d'évaluer le potentiel thérapeutique d'un nouveau pseudopeptide antimicrobien, nommé Pep16, à la fois in vitro et in vivo pour le traitement de l'arthrite septique causée par Staphylococcus aureus. Sept isolats cliniques de S. aureus (dont 1 SARM et 5 SASM) ont été étudiés. Les CMI de Pep16 et des comparateurs (vancomycine, teicoplanine, daptomycine et lévofloxacine) ont été déterminées par la méthode de microdilution en bouillon. L'activité intracellulaire de Pep16 et de la lévofloxacine a été évaluée en utilisant deux modèles d'infection, avec des cellules phagocytaires non-professionnelles (ostéoblastes MG-63) ou professionnelles (macrophages THP-1). L'impact de Pep16 sur la dynamique de croissance du biofilm a été évalué. Un modèle murin d'arthrite septique a été utilisé pour évaluer l'efficacité in vivo de Pep16. Une analyse PK préliminaire a été effectuée en mesurant la concentration plasmatique par LC-MS/MS après une seule injection sous-cutanée de Pep16. Les CMI de Pep16 étaient de 8 mg/L pour tous les isolats cliniques de S. Aureus (de 2 à 32 fois supérieures à celles des comparateurs) tandis que les ratios CMB/CMI confirmaient une activité bactéricide. Tant Pep16 que la lévofloxacine (à 2 x CMI) ont réduit de manière significative la charge bactérienne de tous les isolats testés (2 SASM et 2 SARM) à la fois dans les ostéoblastes et les macrophages. Pep16 a réduit de manière significative les charges bactériennes dans les articulations des genoux des souris infectées par SASM. L'analyse PK après une seule administration sous-cutanée de Pep16 (10 mg/kg) a montré une augmentation lente des concentrations plasmatiques jusqu'à 12 heures (Cmax à 5,6 mg/L).

Le suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des bêta-lactamines permet l’individualisation de la prise en charge d'infections profondes comme l’endocardite infectieuse (EI). La faible diffusion supposée au site infectieux, à savoir les valves cardiaques, est un des éléments qui justifie leur administration à forte dose par voie intra-veineuse. Ainsi, les patients atteints d’EI se voient donc exposés à de fortes concentrations bêta-lactamines pendant 2 à 6 semaines. Dans ce contexte, la survenue d’une neurotoxicité ou d’une néphrotoxicité aux bêta-lactamines peut être lourde de conséquences. Or il existe peu de données de diffusion des bêta-lactamines dans les valves cardiaques et le lien concentration-neurotoxicité des bêta-lactamines est mal documenté en particulier pour l’amoxicilline. Enfin, dans un contexte d’augmentation de l’incidence des EI staphylococciques, la réponse microbiologique aux antibiotiques dans la prise en charge de l’EI à S. aureus est elle-même mal décrite et nécessite d’être évaluée en condition biofilm. Ainsi, la première partie de ce travail a permis d’identifier un seuil de concentrations neurotoxiques en amoxicilline par l’exploitation d’un entrepôt de données intra-hospitalières. La deuxième partie du travail a permis de caractériser au sein d’un essai prospectif une diffusion conséquente des bêta-lactamines au sein des valves cardiaques, en particulier de l’amoxicilline avec un ratio diffusion médian plasma:valve de 62%. Enfin la mise au point d’un modèle ex vivo d’EI à S. aureus sur valves humaines a permis la comparaison de l’activité anti-biofilm de la vancomycine,et d’un lipoglycopeptide; la dalbavancine et d’identifier une activité éradicatrice du biofilm marquée pour cette dernière, fournissant un élément supplémentaire de l’acitivé de la dalbavancine dans l’EI. L’ensemble de ces données a permis d’affiner la fenêtre thérapeutique des anti-infectieux indiqués dans la prise en charge de l’endocardite.

Enterococcus faecium et Staphylococcus aureus sont des bactéries pathogènes opportunistes de l’homme responsables d’épidémies hospitalières. Les antiseptiques sont très utilisés pour prévenir la survenue de ces infections et leur présence dans l’environnement hospitalier, même à faibles concentrations, dites subinhibitrices, constitue un stress auquel ces bactéries doivent d’adapter. Les ARN régulateurs (sARN) sont des acteurs importants pour l’adaptation aux variations environnementales des bactéries. Les preuves de leur existence sont anciennes chez S. aureus mais récentes chez E. faecium, entrainant un état des connaissances très hétérogène. Dans un premier temps, nous avons souhaité caractériser les sARN dont l’expression était altérée en cas de stress antiseptique exercé par de la chlorhexidine, du chlorure de benzalkonium, de la povidone iodée et du triclosan. Nous avons montré que ce stress entrainait une répression globale des sARN étudiés chez E. faecium mais pas chez S. aureus. Dans un second temps, l’étude approfondie d’un sARN d’E. faecium sélectionné, l’Ern0160, a permis de mettre en évidence la toute première cible directe d’un sARN de E. faecium. En effet, l’Ern0160 se lie spécifiquement à un ARN messager dont la protéine correspondante serait impliquée dans la virulence d’après un modèle expérimental murin. L’Ern0160 régule négativement l’expression de sa cible in vitro. L’impact de l’Ern0160 sur l’atténuation de la virulence de E. faecium reste à évaluer in vivo afin d’avoir une vision globale de son rôle dans la pathogénicité de ce dernier.

Staphylococcus aureus est un pathogène opportuniste de l’Homme. La régulation de sa virulence est assurée par l’action coordonnée de facteurs de transcription comme SarA et d’ARN régulateurs. SarA est un régulateur majeur, impliqué dans la formation de biofilm, la résistance aux antibiotiques et l’expression de facteurs de virulence. La détermination de l’ensemble des cibles régulées par SarA présentée dans cette étude permettra de mieux appréhender les réseaux de régulation chez S. aureus. La combinaison d’analyses transcriptomiques (RNA-Seq), de ChIP-Seq et de bio-informatique a mis en évidence 140 gènes régulés par SarA. La régulation transcriptionnelle directe de 9 gènes codant des protéines, et 7 gènes exprimant un sARN a été validée expérimentalement (un sARN se définissant comme un potentiel ARN régulateur). SarA réprime l’expression d’une toxine (sprG2) et d’une antitoxine (sprA2AS) appartenant à deux systèmes toxine-antitoxine de type I distincts. Par ailleurs, l’analyse comparative entre les cibles sARN de SarA et celles publiées pour le facteur de transcription CodY révèle que les gènes sARN teg1, rsaOB, rsaD et teg16 seraient régulés par CodY et SarA de manière coordonnée au cours de la croissance. Ces sARN sont connus ou prédits pour être impliqués dans la synthèse d’acides aminés (méthionine et acides aminés branchés) chez S. aureus. De plus, Teg16 et RsaD semblent partager des fonctions métaboliques communes puisque chacun régule la production d’une acétolactate synthase distincte. Ces travaux mettent en lumière les doubles régulations de gènes sARN par des facteurs de transcription, avec ici l’exemple de SarA et CodY chez S. aureus.

Enterococcus faecium est une bactérie commensale du tube digestif de l’homme, pathogène opportuniste multi-résistant aux antibiotiques et responsable d’épidémies hospitalières. L’existence d’ARN régulateurs chez E. faecium (Ern) ayant récemment été découverte, ce travail de thèse avait pour objectif d’évaluer leur implication in vivo. Un modèle de colonisation a été mis au point chez la souris, à partir de plusieurs modèles décrits dans la littérature. Ils ont été comparés, et un nouveau modèle associant la ceftriaxone et l’amoxicilline a été développé. L’ARN régulateur Ern0160 a ensuite été étudié. Quatre souches d’E. faecium ont été utilisées, Aus0004 (WT), la souche mutante WT délétée d‘ern0160 (Δ0160), la souche Δ0160 trans-complémentée surexprimant ern0160 (Δ0160_0160), et la souche Δ0160 contenant le vecteur pAT29 vide (Δ0160_pAT29). Dans les expériences in vitro, aucune différence n'a été observée entre les souches WT et Δ0160 cultivées seules, tandis que la souche Δ0160_0160 s'est développée plus lentement que Δ0160_pAT29. In vivo, aucune différence significative de colonisation n’a été observée avec les souches inoculées seules. Dans les essais de compétition in vitro et in vivo, la souche WT était prédominante par rapport à la souche délétée Δ0160. Avec la suspension « Δ0160_0160 + Δ0160_pAT29 », la souche Δ0160_pAT29 était prédominante, suggérant un effet délétère de la surexpression d’ern016. Ces résultats suggèrent l'implication d'Ern0160 dans la colonisation intestinale par E. faecium. Des modèles d’infection (endocardite infectieuse et bactériémie secondaire à une translocation intestinale) ont été développés au cours de ce travail mais restent à finaliser.

Enterococcus faecium est un pathogène opportuniste multi-résistant aux antibiotiques, adapté à l’environnement hospitalier et responsable de nombreuses épidémies hospitalières. L’étude de la réponse au stress antibiotique a récemment permis la mise en évidence des premiers petits ARN exprimés chez E. faecium. Ce travail de thèse s’inscrit dans la détermination des fonctions de certains de ces ARN, notamment en lien avec l’antibio-résistance. Nous avons pu identifier ces ARN soit comme des régulateurs localisés dans la région 5’ non traduite (5’UTR) du gène régulé soit comme des ARN régulateurs bona fide. Une investigation fonctionnelle de deux de ces régulateurs situés en 5’UTR a été effectuée par des approches génétiques, transcriptomiques et phénotypiques. Le premier, ern0030, est impliqué dans la régulation du gène de résistance aux tétracyclines tet(M). Nos travaux apportent de nouvelles données expérimentales suggérant l’existence d’un mécanisme de régulation alternatif à celui d’atténuation transcriptionnelle initialement décrit. Le second, ern2050, est un régulateur de type T-box riboswitch impliqué dans la régulation des deux aminoacyl-synthétases HisS et AspS. Nous avons validé expérimentalement ce premier T-box riboswitch chez E. faecium. Cette investigation a également permis de mettre en place un milieu chimiquement défini ayant permis la détermination des acides aminés essentiels chez l’espèce E. faecium et de décrire l’impact de l’absence de régulation de l’opéron hisS-aspS sur la croissance bactérienne dans un milieu pauvre en aspartate. Les données transcriptomiques obtenues ont permis de révéler un autre T-box riboswitch spécifique de l’ARNtHis, ern1900.

Staphylococcus aureus est une bactérie à Gram positif fréquemment trouvée dans la flore commensale de la peau. Elle est capable de s’adapter aux changements environnementaux grâce à la reprogrammation rapide de l'expression génique modulée par des ARN régulateurs, parmi d’autres facteurs. Au cours de ma thèse, mes travaux ont porté sur un nouvel ARN régulateur, appelé SprY (alias S629), avec l’objectif de comprendre sa fonction biologique. Dans un premier temps, nous avons étudié le profil d'expression de l'ARN SprY au cours de la croissance bactérienne et dans des conditions de stress. Ensuite, nous avons identifié plusieurs cibles directes pour SprY par des prédictions in silico et in vivo par MAPS (MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach). Parmi toutes les cibles identifiées, nous nous sommes intéressés au gène SAOUHSC_03046 codant pour un régulateur transcriptionnel des protéines de la famille XRE, SAOUHCS_1342a codant pour la protéine des canaux mécanosensibles et RNAIII, qui est le riborégulateur principal de la virulence de S. aureus. Nous avons démontré que SprY interagit avec les ARNm de SAOUHSC_03046 et SAOUHSC_1342a au niveau de leur RBS (Ribosome Binding Site) et empêche l'initiation de la traduction de ces cibles. La caractérisation de l'interaction entre SprY et RNAIII a montré que SprY agit comme une éponge pour RNAIII et modifie la régulation de l'expression de plusieurs cibles de ce riborégulateur. SprY réduit également l'activité hémolytique de S. aureus pendant l'infection. L’ensemble de ces résultats ont montré que SprY joue le rôle d’éponge pour RNAIII et sa contribution dans la pathogénicité de S. aureus.

Les ARN régulateurs (ARNreg) jouent un rôle central dans les réseaux de régulation bactériens. Chez Staphylococcus aureus, beaucoup sont décrits mais seulement un faible nombre sont rattachés à la régulation de la virulence avec des données parcellaires sur leur expression in vivo. Ce manque témoigne de la difficulté d’obtenir de tels résultats. Nous avons donc développé un modèle d'infection alternatif en utilisant la larve Galleria mellonella pour analyser les rôles des ARNreg de S. aureus au cours de l'infection et déterminer l'implication éventuelle de certains ARNreg dans la virulence staphylococcique. Après avoir développé ce modèle d’infection sur des aspects microbiologiques et histopathologiques, nous avons mesuré l’expression d’ARNreg in situ en cours d’infection. Les profils d'expression des ARNreg testés étaient distincts et fluctuaient dans le temps. L'expression de sprD et sprC augmentait progressivement pendant l'infection et était associée à la mortalité, tandis que l'expression de l’ARNIII restait à peine détectable dans le temps. Une forte corrélation a été observée entre l'expression de sprD et la mortalité. Pour confirmer ces observations préliminaires, nous avons relié les résultats d’expression à la pathogénèse de S. au-reus par utilisation de souches délétées pour certains ARNreg. Nous avons constaté que la mortalité était diminuée lorsque sprD et sprC étaient absents. Ces résultats démontrent la pertinence de ce modèle pour étudier le rôle des ARNreg impliqués dans la virulence de S. au-reus. Ce modèle constitue une méthode rapide et facile pour déterminer la participation des ARNreg dans la pathogenèse de S. aureus.

Staphylococcus aureus est un pathogène humain important responsable d’un large spectre d’infections communautaires et nosocomiales faisant de lui un problème majeur de santé publique dans le monde. Le passage de commensalisme à la pathogénie est régi par la régulation fine de l’expression des gènes. En plus des facteurs de transcription, les ARNs régulateurs jouent également un rôle clé dans cette régulation. Cette thèse s’intéresse plus particulièrement à l’étude de l’un d’entre eux, le srn_3610_sprC, dont l’implication dans la virulence et dans l’internalisation des bactéries par les macrophages humains a été démontrée. Dans le but de mieux comprendre ces effets, nous avons mis en place la technique MAPS et identifié trois ARNm : czrB, deoD et agrB. La caractérisation de l’interaction entre SprC et czrB a révélé une régulation négative de SprC sur l’opéron czrAB par modification de la stabilité de l’ARN. Ce mécanisme de régulation conduit à une diminution de la résistance de S. aureus au zinc. Le zinc fait partie des stratégies antibactériennes mises en œuvre par les cellules humaines. En plus de la description de la régulation par Srn_3610_SprC, nous avons développé un protocole pour l’’extraction des ARNs bactériens après internalisation par les macrophages. Cette nouvelle méthode a permis d’étudier l’implication de l’opéron czrAB dans l’internalisation et la survie intracellulaire de S. aureus. Nous avons ainsi pu montrer qu’il était fortement surexprimé dans un contexte intracellulaire. Ainsi, la régulation négative de SprC sur l’expression de czrB pourrait expliquer la diminution de la survie de S. aureus au sein des macrophages.

Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène humain majeur dont l’impact sur la santé publique est majoré par les phénomènes de résistance et de tolérance aux antibiotiques. Au cours de cette thèse, nous avons identifié deux nouveaux systèmes toxine-antitoxine (STA) de type I appartenant au core génome et exprimés par S. aureus nommés sprG2/SprF2, sprG3/SprF3. Ces nouveaux STA sont homologues au STA sprG1/SprF1 localisé dans un îlot de pathogénie. Nous avons montré que des interactions croisées influençant le niveau des ARN sprG et SprF pouvaient avoir lieu entre les STA homologues sprG/SprF, mais que celles-ci n’avaient pas d’impact sur la neutralisation spécifique de chaque toxine SprG par son antitoxine SprF. Nous avons démontré que les peptides encodés par sprG2 et sprG3 sont bactériostatiques, contrairement aux peptides encodés par sprG1 qui sont bactéricides. Nous avons démontré que l’expression des ARN sprG et SprF pouvait varier en réponse à des stress environnementaux comme un stress hyperosmotique ou un stress oxydatif. Pour le STA sprG1/SprF1, nous avons démontré que l’antitoxine SprF1 pourrait participer à l’entrée en persistance de S. aureus, en atténuant la traduction globale via son association aux ribosomes. Ainsi, SprF1 est le premier exemple d’une antitoxine ARN avec une double fonction de neutralisation de la toxine sprG1 via son extrémité 3’ et de fixation aux ribosomes pour atténuer la traduction de S. aureus via son extrémité 5’. Ensemble, ces travaux de thèse suggèrent que les STA sprG/SprF seraient impliqués dans l’adaptation de S. aureus au stress antibiotique ou dans l’échappement au système immunitaire.