Les nouvelles substances psychoactives (NPS) représentent un défi croissant pour la toxicologie clinique, médico-légale et les politiques de santé publique. Leur propagation rapide, leur diversité chimique et leur faible niveau de caractérisation analytique compliquent leur identification et leur interprétation toxicologique. Le métabolisme de ces substances, souvent inconnu, constitue un verrou important à la caractérisation de biomarqueurs fiables de consommation. Cette thèse propose une approche transversale visant à identifier des métabolites pertinents de plusieurs NPS à travers une combinaison de modèles expérimentaux (in vivo, in vitro, ex vivo), de prédictions in silico, et de traitement bio-informatique de données par réseau moléculaire. Des études portant sur l’eutylone, le 25E-NBOH ou encore l’AP-237 illustrent l’intérêt de croiser les données issues de matrices humaines réelles, de lignées cellulaires et de modèles alternatifs. L’utilisation de la spectrométrie de masse haute résolution (LC-HRMS), couplée à des outils bio-informatiques comme le réseau moléculaire, a permis d’identifier de nouveaux métabolites comme marqueurs de consommation. Ce travail souligne la complémentarité des approches et propose un arbre décisionnel pour guider les futures investigations métaboliques sur les NPS émergents. Ces résultats apportent des éléments nouveaux pour la communauté scientifique, et complètent les outils de détection en contexte clinique ou médico-légal. Ils ouvrent la voie à des stratégies plus réactives, robustes et anticipatrices pour faire face à l’évolution rapide des substances de synthèse sur le marché illicite.