Ces dernières années, de considérables progrès ont été obtenus en médecine génomique. L’apport de la technologie de séquençage haut-débit dans les laboratoires de génétique médicale a notamment permis de mieux diagnostiquer les pathologies génétiques rares. Malgré cette avancée, un nombre important de patients diagnostiqués se retrouvent en errance thérapeutique. Environ 250 millions de personnes souffrent de pathologies génétiques rares et moins de 5% de ces pathologies disposent aujourd’hui de traitements efficaces. La découverte et l’amélioration constante des outils CRISPR/Cas9 ont ouvert la porte à une nouvelle médecine, la chirurgie du génome. Dans ce contexte, une partie importante des altérations génétiques responsables de maladies rares peuvent être en théorie directement corrigées par cette approche, ouvrant une perspective thérapeutique inespérée pour des patients étant parfois les seuls porteurs de ces altérations génétiques. Au cours de ma thèse, j’ai l’opportunité de développer et d’évaluer les outils d’édition du génome CRISPR/Cas9, d’une part pour concevoir et mesurer l’efficacité de nouveaux traitement in vitro, et d’autre part pour installer et décrypter le rôle biologique de variants génétiques de signification inconnue. Désormais, il est possible de corriger ou créer ces variants en recherche fondamentale afin d’aider les cliniciens à conclure sur leur rôle biologique ouvrant la porte à des thérapies personnalisées dans un futur proche.

L’adénocarcinome canalaire pancréatique (ADCP) et le cholangiocarcinome distal (CCD) constituent un groupe de cancers digestifs très similaires au pronostic sombre. Dans ce travail, nous avons, grâce à une approche transversale (transcriptomique, histologique et plasmatique), tenté de caractériser ces tumeurs et d’identifier des biomarqueurs pronostiques. Par une approche ciblée du microenvironnement tumoral (MT) de l’ADCP nous avons mis en évidence d’importantes altérations au niveau moléculaire. Nous avons notamment identifié, le rôle indépendant du MT dans les processus associés à l’agressivité et la progression du cancer. La protéine Stratifin, dont le gène a été identifié comme up-régulé dans le transcriptome du MT, a été confirmée comme surexprimée au niveau tissulaire dans le MT d’une cohorte monocentrique d’ADCP réséqués. Nous avons démontré que son expression tissulaire était associée de manière significative et indépendante à un mauvais pronostic. Ces résultats ont été confirmés dans une cohorte indépendante histologique multicentrique d’ADCP réséqués avec deux relectures de pathologistes. Au niveau plasmatique nous avons identifié que le caractère sécrété de la Stratifin et nous avons démontré qu’un niveau plasmatique élevé était associé un risque de récidive de l’ADCP. Pour finir nous avons comparé au niveau moléculaire l’ADCP et le CCD. A partir de tumeurs totales, nous avons démontré que le profil transcriptomique du CCD est plus proche de l’ADCP que du reste des tumeur biliaires. Ces résultats soutiennent hypothèse de l’existence d’une entité commune constitué par ces deux cancers. Notre travail apporte nouveau regard sur les tumeurs du carrefour bilio-pancréatique. L’étude du MT de l’ADCP a permet d’identifier un nouveau biomarqueur pronostic qui doit être confirmé dans un travail prospectif.

Le maintien de l’intégrité de l’ADN et des protéines est un processus essentiel pour la cellule. Il dépend principalement de la réponse aux dommages à l’ADN (DNA Damage Response, DDR) et de la réponse UPR (unfolded protein response). La DDR permet de détecter et de réparer les dommages à l’ADN tandis que l’UPR maintient l’homéostasie des protéines. Des perturbations dans l’intégrité génomique ou l’homéostasie protéique sont impliquées dans de nombreuses maladies dont des cancers. Toutefois, l’interaction entre la DDR et l’UPR est très peu étudiée. Seules quelques études suggèrent l’existence de liens entre la DDR et l’UPR, majoritairement après des cassures double brin (DB) de l’ADN, et impliquent en particulier IRE1α, un acteur majeur de l’UPR. Le travail de ma thèse a donc consisté à déterminer le rôle d’IRE1α dans la DDR. Nos résultats révèlent l’implication d’IRE1α dans une voie de réparation de l’ADN après des cassures DB : la recombinaison homologue (HR). Étonnamment, seule la sous-expression d’IRE1α, mais pas l’inhibition de son activité ribonucléasique, influe sur le taux de réparation par HR. La sous-expression d’IRE1α induit également une augmentation du taux de phosphorylation d’H2AX, un marqueur des cassures DB de l’ADN. L’analyse du mécanisme d’action d’IRE1α sur la HR a révélé un impact d’IRE1α sur les phosphorylations, ainsi que sur sa présence aux cassures DB, d’une protéine clé de la HR : RPA. De plus, nos travaux ont permis de déterminer que le rôle d’IRE1α dans la HR dépendait de son domaine linker. Nous avons finalement montré que l’interaction entre la réponse UPR et la DDR n’est pas restreinte à IRE1α mais implique également les deux autres médiateurs de l’UPR, i.e. ATF6 et PERK, qui jouent des rôles distincts dans la DDR. Les résultats obtenus révèlent un rôle d’IRE1α, dépendant de RPA et du domaine linker d’IRE1α, dans la réparation de l’ADN par HR et ouvrent ainsi la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter l’efficacité des chimiothérapies anticancéreuses basées sur un stress génotoxique.

Le prototype de récepteur CD95 est une glycoprotéine transmembranaire de type I qui, comme d'autres membres de la famille des récepteurs du TNF, est exprimée de manière ubiquitaire dans les tissus sains et pathologiques. Son ligand naturel CD95L est une protéine transmembranaire de type II principalement exprimée à la surface des lymphocytes T cytotoxiques. La stimulation de CD95 par son ligand physiologique va induire son oligomérisation et le recrutement, via ses domaines intracellulaires, de plusieurs protéines impliquées dans la transduction soit des signaux apoptotiques, soit des signaux non-apoptotiques. Au cours des vingt dernières années, plusieurs études ont démontré l'implication du couple CD95L/CD95 dans l'étiologie de diverses pathologies. Il apparaît que la forme clivée de CD95L joue un rôle clé dans l'induction de plusieurs voies non-apoptotiques, telles que la prolifération cellulaire et la migration. De plus, il a récemment été observé que la concentration de CD95L clivé est augmentée dans le sérum de patients atteints de pathologies telles que certains cancers, maladies auto-immunes et inflammations chroniques et, plus important encore, elle est corrélée à la progression de ces maladies. Il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent ce clivage. Les métalloprotéases matricielles sont des enzymes protéolytiques capables de dégrader tous les composants de la matrice extracellulaire. Des études antérieures ont montré leur implication dans le clivage de certains membres de la superfamille des ligands TNF. Ma thèse de doctorat vise à identifier les protéases impliquées dans le clivage de CD95L et à localiser précisément ces sites de clivage. Nous avons identifié quatre métalloprotéases impliquées dans le clivage du domaine extracellulaire de CD95L, en utilisant des approches biochimiques basées sur le clivage in vitro de protéines recombinantes et de peptides synthétiques. Par la suite, en utilisant la spectrométrie de masse couplée à la LC (LC-MS/MS), nous cartographions précisément les sites de clivage. Cette étude fournit le premier criblage systématique du clivage de CD95L par les métalloprotéases, qui jusqu'à présent n'avait été que très partiellement décrit. Nous confirmons une partie des données précédemment décrites de la littérature, identifions de nouvelles protéases impliquées dans le clivage de CD95L et décrivons de nouveaux sites de clivage. Dans l'ensemble, nos observations soulignent que si les études sur le potentiel thérapeutique du CD95L soluble sont prometteuses, on en sait peu sur les mécanismes moléculaires et physiologiques associés à la libération protéolytique du CD95L soluble. Ces travaux ont contribué à combler un manque de la littérature scientifique et apportent des observations essentielles pour le développement de nouvelles options thérapeutiques ciblant la forme soluble du CD95L.

Pour détecter le cancer de la vessie (CV), la cytologie urinaire et la cystoscopie sont les premiers tests diagnostiques utilisés. La cytologie urinaire est non invasive, facile à collecter, avec une sensibilité moyenne et une spécificité élevée. C’est un moyen efficace de détecter les CV de haut grade, mais elle est moins efficace sur ceux de bas grade. Récemment, les propriétés fluorescentes des membranes plasma-tiques des cellules tumorales urothéliales, appelées fluorescence périmembranaire (FPM), trouvées dans la cytologie urinaire, se sont avérées être d’une utilité potentielle pour améliorer la détection précoce du CV. L’objectif principal de cette thèse a été de caractériser la FPM permettant la détection des cellules tumorales urothéliales dans l’urine. Durant ces travaux nous nous sommes intéressés au rôle que joue la caractéristique morphologique de la cellule urothéliale tumorale dans la FPM. Nous avons ensuite essayé de trouver un modèle de lignées cel-lulaire qui ne présentait pas de FPM dans l’objectif de cribler sa composition protéique et lipidique avec notre modèle du CV. Pour analyser de façon précise la moindre fluctuation de fluorescence, un logiciel de quantification de la FPM a été mis en place. Ne parvenant pas à trouver de lignées sans FPM, nous avons analysé la FPM des cellules urothéliales récupérées dans les urines de rat avec celles récupérées direc-tement dans l’urothélium de rat. En constatant une différence de FPM en fonction d’où les cellules ont été récupérées, nous avons voulu déterminer quel phénomène cellulaire pouvait intervenir dans la modification de la FPM quand la cellule urothéliale passe de l’urothélium aux urines. Les résultats obtenus ont donc permis de mieux comprendre et caractériser le phénomène de FPM. En vus de nos résultats, nous suggérons que la forte résistance des celles tumorales aux agressions extérieures leur permet de mieux survivre dans les urines, contrairement aux cellules saines qui, une fois en suspen-sion, sont plus sensibles à ces agressions responsables de la perte de leur FPM.

Les cancers du sein sont une pathologie complexe et très hétérogène qui peut-être divisée en plusieurs sous-types selon leurs caractéristiques biologiques. Parmi ces sous-types, les cancers dits “triple négatifs” (TN) sont caractérisés par un marquage immunohistochimique négatif pour les récepteurs à l’oestrogène et à la progestérone et ne présentent pas de surexpression de HER2. Ces tumeurs très agressives représentent 10 à 20% des cancers du sein et sont actuellement traitées par chimiothérapie classique contrairement aux tumeurs non-TN qui bénéficient de thérapies ciblées (traitements hormono-dépendants, anticorps neutralisants). Un taux élevé de rechute et de métastases dans les cinq ans après diagnostic est observé chez les patientes TN, en lien avec le développement de résistances à la chimiothérapie. De ce fait, la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans ce processus est importante pour le développement de meilleures thérapies. Les études précédemment menées par notre équipe sur le récepteur de mort CD95 et son ligand, le CD95L, ont mis en évidence leur fonction pro-oncongénique dans les cancers TNs. En effet, en comparaison aux patientes non-TNs, les patientes TNs présentent un taux plus élevé de CD95L (cl-CD95L) dans leur sérum, ce qui est associé à un mauvais pronostic. De plus, in vivo, le cl-CD95L promeut la dissémination métastatique des cellules TNs à travers la formation d’un complexe appelé MISC (Motility-Inducing Signalling Complex) et l’induction de la voie non-apoptotique PI3K/Akt/mTOR. Bien que ces nouvelles données enrichissent notre compréhension du processus oncogénique des cancers TNs, beaucoup reste à faire pour le développement de nouvelles thérapies ciblées. Deux axes de recherche ont été abordés durant mes travaux de thèse. Le premier axe s’inscrit dans la continuité des résultats précédemment obtenus par l’équipe et a consisté à développer de nouveaux inhibiteurs pour bloquer le processus de migration induit par le récepteur de mort. Le second axe propose de définir comment les acteurs majeurs de la machinerie apoptotique, et plus particulièrement les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et BclxL, contribuent à promouvoir la dissémination métastatique des cellules cancéreuses mammaires. Nos travaux ont mis en évidence que l’inhibition de ces membres de la famille Bcl-2, par l’utilisation de BH3 mimétiques, pourrait s’avérer être une stratégie thérapeutique originale pour prévenir la dissémination de métastases chez les patientes TNs.

Le récepteur de mort CD95 participe à de nombreuses fonctions physiologiques en transmettant des signaux apoptotiques. Son ligand membranaire, CD95L, est principalement exprimé à la surface des lymphocytes et contrôle ainsi l’homéostasie cellulaire et l’élimination des cellules infectées ou transformées. Certaines situations pathologiques conduisent à une expression ectopique du CD95L par d’autres types cellulaires,associé à son clivage par des métalloprotéases (cl-CD95L). La forme soluble ainsi libérée perd sa capacité à transmettre l’apoptose mais déclenche l’activation de voies non-apoptotiques induisant l’inflammation dans des maladies inflammatoires chroniques comme le lupus érythémateux systémique (LES) ou encore les formes métastatiques du cancer du sein. Dans ces deux pathologies, de fortes quantités de cl-CD95L sont détectées dans le sérum de ces patients et ont été associés à la progression des pathologies. Dans le LES, nous établissons que cl-CD95L contribue au processus inflammatoireen favorisant la transmigration endothéliale des lymphocytes Th17. Cette migration cellulaire dépendante de CD95 nécessitele recrutement de la PLCγ1 sur le domaine juxta-membranaire de CD95 qui induitl’activation du signal calcique. Pour identifier d’autres partenaires moléculaires de CD95, une analyse protéomique a été réalisée et a permis d’identifier une association entre CD95 et la machinerie traductionnelle. Cette interaction nécessite le recrutement d’eIF4A1 au niveau du domaine juxta-membranaire de CD95. Nous avons par ailleurs montré que dans des lignées cancéreuses mammaires, eIF4A1 participe à la traduction de certaines protéines comme la sérine-thréonine kinase Akt pour faciliter l’activation de la voie de signalisation PI3K et la migration cellulaire induite par CD95. Cette étude a donc mis en évidence l’implication d’un nouveau domaine de CD95 dans l’induction des signaux non-apoptotiques. Ce domaine juxta-membranaire a été nommé CID pour « calcium inducing domain ». De plus, ce domaine fusionné à un peptide perméant provenant de la protéine TAT appelé TAT-CIDa montré son efficacité pour inhiber la migration lymphocytaire chez les souris lupiques et offre de nouvelles perspectives pour le développement de traitements améliorants les symptômes inflammatoires du LES.