La circulation extracorporelle (CEC) utilisé en chirurgie cardiaque ou en réanimation pour la prise en charge d’un choc cardiogénique (ECMO) est associé à la survenue d’infections nosocomiales assombrissant le pronostic des patients. Ces infections sont l’expression de dysfonctions immunitaires induites par la CEC. La première partie de notre travail s’est attaché à décrire les modifications phénotypiques des différentes populations immunitaires induites par l’ECMO. Nous avons pu mettre en évidence que cette CEC induisait un recrutement de polynucléaires neutrophiles (PMN) immatures et une anergie lymphocytaire caractérisée par une apoptose marquée ainsi qu’une diminution des capacités de prolifération. Nous avons poursuivi notre travail par l’étude exhaustive des PMN au cours de la chirurgie cardiaque avec CEC. Cette technique induit le recrutement de PMN matures aux fonctions de bactéricidie intactes n’expliquant donc pas la susceptibilité des patients aux infections post-opératoires. Finalement, comme l’ECMO, la CEC de chirurgie cardiaque induit une augmentation de l’apoptose lymphocytaire ainsi qu’une diminution des capacités de prolifération. Ces anomalies sont associées au recrutement de cellules immunosuppressives, les Myeloïd Derived Supressor Cells qui, via leur activité arginase, entraine une diminution de la disponibilité en arginine. Cet acide aminé est indispensable aux fonctions lymphocytaires et notre connaissance du métabolisme de l’arginine au décours des état inflammatoires sévères nous a permis de montrer que la supplémentation en citrulline permet de corriger plus efficacement l’hypoargininémie. La supplémentation en citrulline laisse entrevoir de nouvelles perspectives thérapeutiques afin de limiter les conséquences des phénomènes immunosuppresseurs induits par la CEC.

La régénération de la moelle osseuse après chimiothérapie ou irradiation nécessite l'existence de cellules stromales fonctionnelles. Néanmoins, les processus impliqués dans la régénération des cellules stromales après agression restent à ce jour peu connus. Dans ce travail nous avons développé et caractérisé un modèle murin d’étude de la régénération de la niche hématopoïétique basé sur la greffe d'un fémur intact en sous-cutané. Après une destruction initiale de la moelle osseuse, la cavité médullaire est le siège d’une infiltration par des adipocytes puis d’une régénération progressive avec la réapparition d'une niche hématopoïétique fonctionnelle. De manière inattendue, nous avons identifié des cellules stromales localisées au niveau du périoste capables de migrer dans la moelle osseuse et de contribuer à la régénération du compartiment stromal médullaire. Les cellules stromales issues du périoste sont capables de d’acquérir des caractéristiques de cellules souches mésenchymateuses médullaires avec notamment l'expression de cytokines majeures pour l'hématopoïèse comme Cxcl12 et Stem cell factor. L’observation que les cellules stromales du périoste, contrairement aux cellules stromales médullaires, survivent à la procédure de greffe suggère que ces cellules sont plus résistantes au stress possiblement en lien avec une importante quiescence. En conclusion, notre travail met en évidence une nouvelle fonction des cellules stromales du périoste soulignant leur importante plasticité et le rôle potentiel du périoste comme une source de cellules stromales mésenchymateuses après agression de la moelle osseuse.

Le lymphome folliculaire est l'un des exemples paradigmatiques des cancers dépendant d'un microenvironnement tumoral spécifique. Il comprend notamment des fibroblastes associés au cancer (CAF) émergeant de la reprogrammation des cellules stromales lymphoïdes ou de leur(s) précurseur(s) dans le ganglion et la moelle. Les cellules stromales dans le lymphome folliculaire soutiennent directement la croissance des cellules B malignes et orchestrent la niche tumorale en contribuant, par un dialogue bidirectionnel, au recrutement et à la polarisation d'autres sous-populations immunitaires. Une meilleure compréhension des voies de signalisation et des mécanismes moléculaires responsables du remodelage des cellules stromales et de la cinétique de ce dernier seraient utiles pour définir de nouveaux marqueurs prédictifs et de nouvelles approches thérapeutiques dans ce cancer encore incurable. Les modèles in vitro récapitulant les forces biomécaniques, le microenvironnement cellulaire et l'organisation spatiale des lymphomes B restent rares, alors que tous ces paramètres constituent des éléments clés déterminants dans la lymphomagenèse et la résistance aux médicaments. En utilisant une méthode microfluidique basée sur l'encapsulation de cellules dans des microsphères d'alginate perméables, nous avons développé un nouveau modèle 3D incorporant des cellules B de lymphome, de la matrice extracellulaire et/ou des cellules stromales d’amygdale. Nous avons montré que les cellules de lymphome B étaient capables de former des sphéroïdes cohésifs résultant de la surexpression des composants de la matrice extra-cellulaire. De plus, dans ce modèle, les cellules stromales s’auto-organisent pour initier la prolifération des cellules tumorales. La culture 3D induit une résistance à l'agent chimiothérapeutique classique doxorubicine, mais pas à l'inhibiteur de BCL2 ABT-199, identifiant cette approche comme un modèle in vitro pertinent pour comprendre l’activité des agents thérapeutiques . L'analyse RNAseq a mis en évidence des modulations des voies de signalisation similaires à celles observées dans les cellules primaires de lymphome folliculaire. Enfin, notre modèle a permis la survie à long terme in vitro de cellules B primaires de lymphome folliculaire. Nous proposons ainsi un nouveau modèle 3D imitant la niche tumorale du lymphome et permettant d'étudier la relation dynamique entre les cellules tumorales et leur microenvironnement pour les tests de nouveaux médicaments anticancéreux. En parallèle, nous avons pour la première fois, initié la caractérisation d’une niche tumorale jusqu’alors jamais explorée dans le lymphome folliculaire, située dans le tissu adipeux péri-ganglionnaire. Dans cette niche, les cellules tumorales évoluent au contact de cellules stromales adoptant un phénotype CAF associé aux tumeurs solides, et de macrophages associés aux tumeurs de phénotype M2.

Les cellules stromales lymphoïdes (CSL) tiennent un rôle central dans la physiologie des organes lymphoïde secondaire. Elles sont nécessaires à la migration et la régulation des cellules immunitaires via la sécrétion de chimiokines, telles que CCL19, CCL21 ou CXCL13, et l’expression de protéines d’adhésions, tel que PDPN, ICAM-1 et VCAM-1. La différenciation et l’activation de ces cellules dépendent de deux facteurs indispensables : le TNF alpha et la lymphotoxine alpha1beta2. Cependant, les précurseurs mésenchymateux dont elles dérivent sont à ce jour peu décrits. De manière intéressante, ces précurseurs mésenchymateux peuvent se différencier en d’autres types cellulaires sous le contrôle de mécanismes épigénétiques, soulevant l’intérêt d’étudier l’intervention de tels mécanismes lors la différenciation stromale lymphoïde. Dans ce travail de recherche, nous mettons en évidence la surexpression d’un facteur épigénétique, KDM6B, lors de la polarisation in vitro d’immunofibroblastes et lors de la formation de structure lymphoïde tertiaire chez la souris, en lien avec l’acquisition d’un phénotype de type stroma lymphoïde. De plus, l’expression de KDM6B est associée à une modification précoce de la marque histone H3K27ac, au cours de cette polarisation, au niveau des régions régulatrices de gènes immunorégulateurs tels que ICAM-1, PDPN, CCL2 ou encore CCL5. L’inhibition de ce facteur bloque l’acquisition du phénotype lymphoïde et limite ainsi les propriétés fonctionnelles de ces cellules, telles que le recrutement de monocytes. Ces résultats mettent ainsi en avant KDM6B comme une cible thérapeutique potentielle afin de bloquer l’apparition d’un stroma lymphoïde de soutien lors de pathologie auto-immune ou lors de cancers.

Depuis leur première utilisation clinique en 2001 dans l’ostéogénèse imparfaite, l’engouement pour le recours aux cellules stromales mésenchymateuses (MSC) comme approche thérapeutique dans le traitement des désordres dysimmunitaires, en médecine régénératrice et plus récemment dans la prise en charge de patients atteints d’une infection à coronavirus (COVID19) ne cesse d’augmenter. Cependant, des résultats contradictoires dus à la variabilité des procédés de production, à la diversité des patients inclus et des pathologies ciblées perturbent le développement de cette approche thérapeutique. De plus, l’hétérogénéité des MSC elles-mêmes rend difficile leur caractérisation fonctionnelle. Par ailleurs, la phase d’amplification en culture n’est pas associée à un risque de transformation mais peut entraîner une entrée en sénescence qui peut impacter leurs propriétés. Initialement, leur efficacité a été attribuée à leur capacité de différenciation, il est maintenant avéré que c’est leur pouvoir immunorégulateur qui. Dans ce travail, nous avons étudié plusieurs facteurs de variabilité qui jouent un rôle dans l’efficacité thérapeutique des MSC. Tout d’abord, nous avons validé que l’origine tissulaire des MSC impacte fortement leurs propriétés : les MSC dérivées du tissu adipeux ont des fonctions immunorégulatrices plus intéressantes que les MSC dérivées de la moelle osseuse pour leur utilisation thérapeutique. Par ailleurs, nous avons démontré que la capacité à inhiber les lymphocytes T diminue lorsque les MSC entrent en sénescence réplicative en raison d’une augmentation de la dégradation de l’enzyme indoléamine 2,3-dioxygénase par le protéasome. Enfin, nous avons montré que dans un contexte inflammatoire, l’interaction des MSC avec les lymphocytes T CD4 via CD40/CD40L entraîne le recrutement des polynucléaires neutrophiles de façon IL8 dépendante. Ainsi, la source tissulaire, l’amplification en culture et la capacité des MSC à interagir avec les cellules immunitaires sont des paramètres qu’il est important d’évaluer grâce à la mise en place de tests de validation afin d’améliorer l’efficacité des études cliniques.

La différenciation terminale des lymphocytes B à travers le centre germinatif conduit à la production de cellules sécrétrices d’anticorps : les plasmocytes (PC) à longue durée de vie et de haute affinité pour l’antigène. Cette réaction implique la formation d’une microstructure anatomique qui comprend une zone sombre : lieu d’intenses proliférations des centroblastes et de maturation d’affinité de leur BCR, et une zone claire dans laquelle ont lieu les commutations de classes isotypiques du BCR et la sélection des centrocytes (CC). Ce processus est finement contrôlé par les lymphocytes T folliculaires auxiliaires (Tfh) notamment à travers la production de molécules comme l’IL-4, le CD40L et l’IL-21. Ce travail de thèse s'intéresse à l'expression du CD23 à la surface des CC lors de leur métamorphose en PC. J'ai d’abord montré que l'expression de ce récepteur de faible affinité aux IgE est régulée par les signaux Tfh : CD40L et IL-4. De plus j'ai mis en évidence que les CC humains exposés aux signaux Tfh mais négatifs pour le CD23 sont capables de se différencier en PC. Dans ce cadre, la signature transcriptionnelle de ces progéniteurs de PC a été étudiée à l'échelle de la cellule unique et a permis d’identifier un gène jusqu’alors jamais décrit dans les PC qui code pour le facteur de transcription DEC2 et dont la fonction reste à déterminer. J'ai par ailleurs étudié l'expression du CD23 dans le lymphome folliculaire et mis en évidence qu’il existe des différences entre les populations tumorales positives et négatives pour le CD23, suggérant que les cellules CD23neg ont un avantage de survie et une capacité de différenciation supérieure en culture que les cellules CD23pos.

La génération de plasmocytes (PC) à longue durée de vie sécrétant des anticorps hautement affins spécifiques de l’antigène, caractéristique de la réponse immune adaptative, est l’étape ultime de la différenciation des lymphocytes B au sein des centres germinatifs des organes lymphoïdes secondaires. La transition d’un lymphocyte B naïf vers un PC est associée au passage d’un programme transciptionnel des gènes de l’identité B vers l’expression des gènes de l’indentité plasmocytaire. Ce travail de thèse s’est concentré sur la caractérisation de cette étape terminale de la différenciation lymphocytaire B humaine tant au niveau transcriptomique qu’épigénétique. A l’aide d’un modèle de différenciation in vitro à partir de lymphocytes B naïfs humains, nous avons identifié les cellules engagées dans ce processus. Ces précurseurs des plasmablates sont notamment caractérisés par une répression de la voie de signalisation de l’IL-4 aboutissant à la perte du marqueur CD23, le récepteur de faible affinité à l’IgE mais aussi à l’apposition de 5hmC, l’hydroxyméthylcytosine, au niveau des gènes de l’identité PC. L’étude de cette marque épigénétique dans un contexte pathologique, le myélome multiple, a fait l’objet du second axe de recherche de notre projet et a révélé le rôle du gène FAM72D dans la prolifération cellulaire.

L’objectif de cette thèse était d’améliorer les connaissances fondamentales sur le tissu adipeux, organe qui est au cœur de la pratique des chirurgiens plasticiens. En effet, ce tissu peut être transplanté de façon autologue afin de combler une perte de substance (rôle volumateur des adipocytes) mais également servir à des fins de régénération tissulaire en lien avec les cellules de la fraction vasculaire stromale (FVS) et tout particulièrement des cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Ces cellules s’obtiennent après lipoaspiration du tissu par une digestion enzymatique de la graisse obtenue. Il s’avère que les connaissances disponibles sur ces CSM sont essentiellement issues d’études in vitro après une phase de culture cellulaire plus ou moins longue et ainsi les propriétés in vivo sont mal connues. Ce travail a donc consisté à caractériser l’hétérogénéité du compartiment stromal natif du tissu adipeux obtenu après digestion enzymatique. Nous avons isolé deux populations stromales natives distinctes : les ASC (CD34+), en grande majorité, et des cellules péricytaires (CD146+). Ces 2 types cellulaires différaient dans leurs phénotypes, leurs potentiels de clonogénécité et leurs propriétés immunomodulatrices in vitro et in vivo. Nous avons ensuite comparé la digestion enzymatique du tissu aux techniques de digestion mécanique utilisable au sein de nos blocs opératoires. Nous avons démontré que ces nouvelles techniques permettaient bien de produite les cellules de la FVS dont des CSM, cellules particulièrement intéressante pour des gestes de régénération tissulaire. De plus, l’ensemble des techniques de laboratoire acquise au cours de ce travail nous ont permis d’investiguer le rôle des techniques de lipoaspiration utilisé en chirurgie plastique sur le tissu adipeux. Nous avons démontré par cytométrie de flux et par immunofluorescence in situ qu’une partie de la trame microvasculaire était conservée. L’ensemble de ces résultats viennent s’ajouter aux données cliniques démontrant que la lipoaspiration du tissu est un geste permettant d’être plus conservateur pour le tissu et pourrait expliquer des taux de complications moindre après chirurgie de contour de la silhouette.