Enterococcus faecium est un pathogène opportuniste multi-résistant aux antibiotiques, adapté à l’environnement hospitalier et responsable de nombreuses épidémies hospitalières. L’étude de la réponse au stress antibiotique a récemment permis la mise en évidence des premiers petits ARN exprimés chez E. faecium. Ce travail de thèse s’inscrit dans la détermination des fonctions de certains de ces ARN, notamment en lien avec l’antibio-résistance. Nous avons pu identifier ces ARN soit comme des régulateurs localisés dans la région 5’ non traduite (5’UTR) du gène régulé soit comme des ARN régulateurs bona fide. Une investigation fonctionnelle de deux de ces régulateurs situés en 5’UTR a été effectuée par des approches génétiques, transcriptomiques et phénotypiques. Le premier, ern0030, est impliqué dans la régulation du gène de résistance aux tétracyclines tet(M). Nos travaux apportent de nouvelles données expérimentales suggérant l’existence d’un mécanisme de régulation alternatif à celui d’atténuation transcriptionnelle initialement décrit. Le second, ern2050, est un régulateur de type T-box riboswitch impliqué dans la régulation des deux aminoacyl-synthétases HisS et AspS. Nous avons validé expérimentalement ce premier T-box riboswitch chez E. faecium. Cette investigation a également permis de mettre en place un milieu chimiquement défini ayant permis la détermination des acides aminés essentiels chez l’espèce E. faecium et de décrire l’impact de l’absence de régulation de l’opéron hisS-aspS sur la croissance bactérienne dans un milieu pauvre en aspartate. Les données transcriptomiques obtenues ont permis de révéler un autre T-box riboswitch spécifique de l’ARNtHis, ern1900.