L'ubiquitination est l’un des principaux types de modification post-traductionnelle des protéines. Cette cascade est responsable de l'ajout d'une petite protéine, l'ubiquitine, à la protéine dite substrat et joue un rôle crucial dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires. Des perturbations de ce mécanisme d’ubiquitination sont à l'origine de nombreuses maladies humaines, telles que le cancer ou des troubles neurodégénératifs. La liaison de l'ubiquitine est catalysée par une cascade enzymatique par quatre classes principales d'enzymes, parmi lesquelles les ligases E3 sont le groupe le plus important, ce qui affecte directement la spécificité des processus d'ubiquitination. Il semble donc que ces enzymes jouent un rôle clé dans l'ubiquitination correcte de substrats spécifiques et peuvent être des cibles potentielles dans le traitement de maladies causées par des perturbations dans les cascades d’ubiquitination. Un nombre limité de paires E3/substrat ont été décrites jusqu'à présent, et celles décrites sont principalement connues par une approche biochimique qui ne correspond pas entièrement aux conditions physiologiques de la cellule. L'objectif de cette thèse était d'étudier les interactions et les substrats putatifs de certaines ligases E3 dans les cellules vivantes afin de maintenir les conditions physiologiques du fonctionnement de ces enzymes. Les travaux ont été réalisés en plusieurs étapes, qui ont consisté à : l’optimisation d'un protocole à haut débit pour détecter les interactions/substrats E3 putatifs dégradés dans une cellule vivante, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de paires d'interacteurs de la ligase E3 et des résidus pertinents pour leur liaison, la vérification de l'interaction des enzymes E3-E2, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de nouveaux substrats putatifs de la ligase E3 destinés à la dégradation via ces voies, la vérification de l'autoubiquitination du domaine RING in vitro. Nous avons utilisé des techniques in vivo modernes basées sur la plus petite et la plus brillante luciférase connue, appelée NanoLuc, y compris le test de complémentation des protéines (PCA) optimisé pour le criblage à haut débit des interactions dans les cellules. Au total, nous avons testé environ 6000 interactions potentielles pour chacune des ligases. Les souches ont toutes été soumises à des mesures de luminescence grâce auxquelles nous avons identifié plusieurs nouvelles interactions non encore décrites dans la littérature. En outre, sur la base de la technique optimisée, nous avons effectué un criblage afin de trouver des changements de protéines à l'échelle du protéome après la mutation de la ligase choisie. Nous n'avons pu détecter que quelques protéines régulées positivement, dont le niveau accru peut suggérer leur dégradation dérégulée après la désactivation de la ligase. Pour résumer, ce travail a identifié les interactions E3/interacteur et E3/E2 et étudié les substrats putativement dégradés dans la levure, et servira de base à d'autres recherches visant à mieux comprendre le fonctionnement du réseau d'ubiquitination dans les cellules.