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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 20-12-2018
Frouard Julie
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Le sperme est le principal vecteur de dissémination du VIH. La muqueuse colorectale exposée au sperme infecté lors de rapports anaux, aussi bien chez l’homme que chez la femme, représente le plus fort risque d’infection parmi toutes les voies de transmission sexuelle. Un nombre croissant d’études suggèrent que la transmission sexuelle du VIH via les cellules infectées présentes dans les sécrétions génitales du donneur serait plus efficace que par les particules virales libres. A ce jour, le rôle et les mécanismes de transmission des cellules infectées du sperme ont été peu étudiés. De plus, l’effet potentiel du liquide séminal (LS) sur cette transmission est mal connu. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de démontrer une transmigration active et rapide: (i) de leucocytes sanguins à travers la barrière colorectale, et un effet inhibiteur du LS sur ce
phénomène, sans altération de la barrière épithéliale. (ii) de leucocytes séminaux. Des analyses par cytométrie de flux ont permis de mettre évidence à la fois des particularités et des similitudes quant à l’équipement protéique des cellules séminales et de leurs équivalents sanguins. Ce travail fournit de nouvelles données sur la transmission du VIH par les cellules infectées du sperme, et sur l’effet du sperme sur la transmission colorectale. La démonstration de la transmigration de leucocytes séminaux suggère que ces cellules jouent un rôle dans la transmission du VIH au niveau colorectale qui nécessite d’être pris en compte dans les stratégies de prévention. Les mécanismes en jeu et ceux responsables de l’effet du LS restent à élucider et devrait permettre à terme de dégager de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Santé publique
/ 19-12-2018
Charuaud Lise
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La Directive Cadre sur l’Eau (2000) fait état de la dégradation du bon état chimique des eaux superficielles et des eaux souterraines. Parmi les polluants émergents mis en cause figurent les résidus de médicaments qui représentent une menace diffuse et potentiellement persistante dans les hydro-systèmes. A ce jour, peu d’études se sont intéressées spécifiquement aux résidus médicamenteux vétérinaires (RMV). En France, la Bretagne est une région d'élevage intensif. 75% des eaux destinées à la consommation humaine (EDCH) sont issues d’eau de surface particulièrement vulnérables. Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse sont de (i) sélectionner les sites à risque et les RMV d’intérêt, (ii) développer une méthode d’analyse pour la liste de composés retenus, (iii) acquérir des premières données d’occurrence par les RMV dans les EDCH en Bretagne et (iv) identifier les sources des RMV à l’aide de l’étude de la contamination fécale associée dans les eaux brutes. Cette thèse est constituée de trois chapitres : une synthèse bibliographique des connaissances relatives aux RMV dans les eaux brutes et les eaux traitées, ainsi qu’une synthèse sur les outils existant pour étudier la contamination fécale ; les matériels et méthodes incluant la stratégie d’échantillonnage, le choix des RMV d’intérêt et les méthodes d’analyse développées sur cette base; les données d’occurrence des RMV dans les EDCH bretonnes. Ces travaux se concluent sur un contexte plus large avec des perspectives pour mieux comprendre les facteurs impactant ces occurrences et pour évaluer l’exposition de la population.
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Epidémiologie, analyse de risque, recherche clinique
/ 12-12-2018
Raffy Gaëlle
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La qualité de l’environnement intérieur est aujourd’hui un sujet de préoccupation majeur en santé publique. Les populations passent près de 90 % de leur temps en environnement intérieur où elles sont exposées à des polluants comme les composés organiques semi-volatils (COSV) suspectés d’effets néfastes pour la santé. L’ingestion de poussières est une voie d’exposition non négligeable à certains de ces COSV, en particulier chez les enfants. Pour caractériser cette exposition, il est nécessaire de prendre en compte la bioaccessibilité orale des COSV, définie comme la fraction de polluant libérée dans le tractus gastro-intestinal et disponible à l’absorption. Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse sont de (i) développer et valider une méthode simple à mettre en œuvre pour la mesure de la bioaccessibilité orale des COSV dans les poussières et (ii) produire des données de bioaccessibilité pour des COSV d’intérêt sanitaire. Cette thèse sur articles est constituée de trois chapitres : un contexte scientifique, qui présente les sources et la toxicité des COSV, puis décrit leur présence dans l’air et les poussières des écoles, avant d’aborder les différentes voies d’exposition humaine ; un état de l’art sur la bioaccessibilité orale des COSV dans les poussières ; la proposition d’une méthode simplifiée pour la mesure de cette bioaccessibilité, sa validation et son application à de premiers échantillons. Ces travaux se concluent sur un contexte plus large que l’ingestion en établissant des perspectives considérant également la bioaccessibilité par inhalation et par contact cutané, afin de caractériser de manière globale l’exposition aux COSV en environnement intérieur.
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Cancérologie
/ 03-12-2018
Dekky Bassil
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Le micro-environnement tumoral joue un rôle dans la croissance, l'invasion tumorale et la résistance aux traitements. Il est essentiel de comprendre les mécanismes qui régulent la communication entre les cellules tumorales et ce micro-environnement pour développer des thérapies efficaces. Dans ce contexte, les protéases extracellulaires de la famille des Adamalysines sont des acteurs importants dans la progression tumorale en agissant sur le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) et la biodisponibilité des médiateurs de communication cellulaire tels que les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance. Mes travaux ont mis en évidence une nouvelle interaction entre ADAM12, un marqueur mésenchymateux induit au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dépendante du TGF-β et ZO-1, une protéine d’échafaudage exprimée dans des jonctions serrées de cellules épithéliales. Ces deux protéines sont redistribuées, dans des structures de type invadopodes pour promouvoir la dégradation de la MEC. Nous avons par ailleurs réalisé un criblage in silico qui nous a permis d’identifier un cluster d’adamalysines dont les gènes sont co-exprimés chez des patients atteints d’un carcinome hépatocellulaire. Parmi ces adamalysines, nous avons mis en évidence la protéine ADAMTS12, qui joue un rôle clé dans le développement de la fibrose hépatique en lien avec une réponse inflammatoire aigüe ou chronique.
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Immunologie
/ 15-11-2018
Chalin Arnaud
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Introduction : Les maladies hépatiques sont un fléau à échelle mondiale avec plus de 844 millions de personnes atteintes. Les étiologies aigües, bien que rares, peuvent prendre une forme gravissime menant à la mort. Les hépatites chroniques représentent la très grande majorité des atteintes à l’échelle mondiale. Bien qu’elles soient un enjeu comparable à d’autres affections chroniques comme le diabète ou les maladies cardiovasculaires, elles demeurent insuffisamment diagnostiquées principalement car ce sont des maladies asymptomatiques. Le processus diagnostic repose actuellement sur l’établissement d’un bilan sanguin puis, en cas d’anormalité et de facteurs de risques associés, d’évaluation de l’étendue de la fibrose et de l’activité nécro-inflammatoire intrahépatique par biopsie hépatique. Pour se substituer à cette pratique invasive, de nombreuses méthodes alternatives émergent dont le Fibroscan. Le nouveau paradigme consiste à associer plusieurs marqueurs non invasifs afin d’accumuler suffisamment de preuves pour augmenter la précision diagnostique et notamment des marqueurs d’inflammation. Dans ce contexte, les chimiokines CXCL10, CXCL11 et CXCL12 qui interviennent dans des évènements chimiotactiques sont des candidats intéressants comme marqueurs d’inflammation ou de fibrose intrahépatique dans le cadre d’affections aigües ou chroniques. Objectif : D’une part, l’objectif de cette thèse a consisté à caractériser ces candidats biomarqueurs sur des cohortes humaines d’affections aigües ou chroniques. D’autre part, l’objectif a été de proposer un nouvel outil pour le dépistage simplifié et délocalisé des maladies hépatiques au travers de la technologie d’immunochromatographie par flux latéral. Patients et Méthode : La caractérisation des biomarqueurs candidats a consisté à mesurer le niveau sérique de ces chimiokines et de les corréler à des étiologies particulières dans le contexte d’affections aiguës ou de données clinico-biologiques de fibrose ou d’inflammations intrahépatiques dans le cadre d’affections chroniques. L'étude sur les atteintes aiguës a concerné 163 patients classés en fonction de l'étiologie. Pour les affections chroniques, l’étude a été menée sur deux étiologies : l’hépatite chronique causée par le virus de l’hépatite C (VHC) (n = 87) et l’alcoolisme chronique (n = 166). Concernant le développement d'un test rapide, une preuve de conception sur la forme cytosolique de l'enzyme AST a été réalisée pour démontrer l'équivalence du dosage entre la méthode de référence (mesure enzymatique) et la méthode développée (mesure immunologique). Pour cela, le dispositif développé a été évalué sur des patients (n = 23) ainsi que sur des sujets en bonne santé (n = 11) afin d'évaluer la spécificité du dispositif. Résultats : Les résultats obtenus sur les patients avec hépatites aigües ont permis d’aboutir à une signature chimiokinique en fonction de l’étiologie. Concernant le VHC, les résultats montrent que CXCL11/CXCL12 sont des biomarqueurs de cirrhose et CXCL10/11 des biomarqueurs d’inflammation intrahépatique. Pour les patients avec alcoolisme chronique, CXCL11 et CXCL12 sont associés également avec la fibrose avancée. De plus, elles sont corrélées à d’autres marqueurs non-invasifs de fibrose hépatique et sont également associés à la présence d’une stéatohépatite. Enfin, le test rapide développé démontre une bonne spécificité et sensibilité sur les échantillons évalués. De plus, une linéarité de mesure est obtenue permettant d’envisager un usage quantitatif avec un lecteur de test adapté. Conclusion : Ces travaux ont permis de caractériser de nouveaux biomarqueurs et de proposer de nouveaux outils pour l’amélioration du diagnostic des maladies hépatiques. De plus, les résultats obtenus soulèvent des questions sur les implications de ces chimiokines dans le processus pathogène des différentes étiologies étudiées et pourraient constituer, le cas échéant, de nouvelles cibles thérapeutiques.Patients et Méthode : La caractérisation des candidats biomarqueurs a consisté à mesurer le relargage sérique de ces chimiokines et de les corréler à des étiologies particulières dans le cadre d’affections aigües ou de données clinico-biologiques de fibrose ou d’inflammation intrahépatique dans le cadre d’affections chroniques. L’étude sur les affections aigües a porté sur 163 patients regroupés selon le type d’affection (virale, médicamenteuse, toxique…). Concernant les affections chroniques, l’étude a été réalisé sur deux étiologies : l’hépatite chronique causée par le virus de l’hépatite C (n=87 patients) et l’alcoolisme chronique (n=166 patients). Concernant le développement d’un test rapide, nous avons choisi de réaliser une preuve de conception sur l’enzyme AST de forme cytosolique afin de démontrer l’équivalence de dosage entre la méthode de référence qui consiste à mesurer l’activité enzymatique et la méthode développé qui repose sur une détection immunologique Pour cela, le dispositif développé a été évalué sur des patients (n=23) dont les concentrations en AST couvrent une large gamme de concentration ainsi que sur des sujets sains (n=11) pour évaluer la spécificité du dispositif. Résultats : Les résultats obtenus sur les patients avec hépatites aigües montrent que les chimiokines étudiées sont retrouvées dans la grande majorité des étiologies avec des différences d’expression selon les étiologies. Concernant l’hépatite C chronique, les résultats montrent que CXCL11/CXCL12 sont des biomarqueurs de cirrhose et CXCL10/11 des biomarqueurs d’inflammation intrahépatique. Ensuite, pour les patients avec alcoolisme chronique, CXCL11 et CXCL12 sont associés également avec la fibrose avancée. De plus, elles sont corrélées à d’autres marqueurs non-invasifs de fibrose hépatique et sont également associés à la présence d’une stéatohépatite. Enfin, le test rapide développé démontre une bonne spécificité et sensibilité sur les échantillons évalués. De plus, une linéarité de mesure est obtenue permettant d’envisager un usage quantitatif avec un lecteur de test adapté. Conclusion : Ces travaux ont permis de caractériser de nouveaux biomarqueurs et de proposer de nouveaux outils pour l’amélioration du diagnostic et du dépistage des maladies hépatiques. De plus, les résultats obtenus soulèvent des questions sur le potentiel rôle et sur les implications de ces chimiokines dans le processus pathogène des différentes étiologies étudiées et pourraient constituer, le cas échéant, de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Toxicologie
/ 29-10-2018
Sayyed Katia
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La fumée de cigarette peut endommager plusieurs organes de notre organisme, causant des maladies chroniques sévères et divers types de cancers. Elle interagit notamment avec les enzymes de métabolisme des médicaments de phase I et II, et contribue ainsi à la perturbation de la pharmacocinétique de divers médicaments chez les fumeurs. Les transporteurs membranaires sont des acteurs majeurs de l'absorption, la distribution et l'élimination de médicaments, et certains sont impliqués dans les interactions médicamenteuses. De plus, ils assurent le flux des molécules endogènes physiologiques vitales, et l'élimination de divers xénobiotiques toxiques non seulement chez les mammifères mais aussi chez les êtres unicellulaires, comme les levures. Ces transporteurs sont des cibles potentielles de la fumée de cigarette. D’où l'importance d'étudier l'interaction de la fumée de cigarette et de ses composés avec les transporteurs membranaires. Nos résultats démontrent que le condensat de fumée de cigarette (CSC) modifie l'activité fonctionnelle et/ou l'expression de plusieurs transporteurs hépatiques et rénaux in vitro dans des modèles cellulaires hépatiques et/ou non-hépatiques, notamment les OATPs (organic anion transporting polypeptide), l'OCT1 (organic cation transporter 1), la BCRP (breast cancer resistance protein) et l'OAT3 (organic anion transporter 3). Une implication remarquable du récepteur Ah (AhR) est mise en évidence dans la régulation de l'expression de certains transporteurs comme la MRP4 (multidrug resistance-associated protein), la BCRP, l'OAT2 et l'OCT1 dans des cellules HepaRG exposées au CSC. De plus, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, le CSC inhibe l'activité d'efflux notamment des transporteurs de la rhodamine 123 et de la caféine, et induit, après trois heures, leur expression avec d'autres gènes qui sont aussi impliqués dans la résistance aux xénobiotiques comme les transporteurs de la membrane plasmique le Pdr5, le Snq2, le Pdr10, le Pdr15 et le Tpo1. Enfin, un effet inhibiteur remarquable des amines aromatiques hétérocycliques (AAH) est mis en évidence in vitro, notamment celui de Trp-P-1 et de Trp-P2 sur l'activité des transporteurs OCT1 et OCT2. De plus, les données in silico suggèrent que des descripteurs moléculaires des AAH comme l'AMW (average molecular weight), la qnmax (maximum negative charge) et le SPP (submolecular molarity parameter), sont des paramètres cruciaux de l'inhibition commune des OCT1, OCT2 et OCT3 par les AAH. Le CSC est donc un modulateur bifonctionnel, qui peut intervenir dans la régulation de l'activité et de l'expression des transporteurs membranaires hépatiques et rénaux, ainsi que ceux chez la levure. De telles interactions peuvent contribuer à l'altération de la pharmacocinétique des médicaments et des composés endogènes chez les fumeurs, d’où l'évaluation de l'exposition hépatique et rénale au CSC demeure indispensable.
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Génétique, Génomique, Bioinformatique
/ 18-10-2018
Lecluze Estelle
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Les organes centraux du tractus urogénital sont le testicule et l’ovaire, qui assurent la production de gamètes et d’hormones, et donc la fertilité de l’individu. Ces deux organes, parfaitement distincts et complémentaires, ont pour origine une gonade bipotentielle qui s’engagera vers une trajectoire de différenciation masculine ou féminine au cours de la vie fœtale. Les deux gonades vont par la suite subir plusieurs phases de différenciation et de développement de leurs populations cellulaires, afin d’acquérir leurs fonctions propres qui leur permettront d’assumer leur rôle à l’âge adulte. Depuis plus d’une quinzaine d’années, le concept de syndrome de dysgénésie testiculaire fait état d’un lien entre l’exposition du fœtus à des composés environnementaux et des anomalies du tractus urogénital. Bien que sujette à de vifs débats au sein de la communauté scientifique, cette hypothèse a attiré l’attention de la recherche sur les conséquences de l’exposition des mères aux xénobiotiques sur l’enfant à naître. La différenciation et le développement des gonades fœtales sont gouvernés par des programmes d’expression spécifiques de chaque sexe, dont de nombreuses zones d’ombres subsistent, notamment concernant la fraction non-codante exprimée par le génome humain. La première partie de cette thèse de doctorat présente, pour la première fois, le paysage transcriptionnel contrôlant ces processus complexes entre la 6ième et 17ième semaine de développement chez l’Homme. Grâce à l’avènement des technologies de transcriptomique, il est désormais possible d’identifier et d’observer l’expression des gènes de manière sensible et sans a priori. Le RNA-seq m’a donc permis de décrire de manière exhaustive la dynamique d’expression des gènes, pendant les stades précoces de la différenciation sexuelle, jusqu’aux phénomènes plus tardifs conduisant aux linéages des différentes populations cellulaires spécifiques du testicule et de l’ovaire. Dans une deuxième partie, mon travail de recherche s’est attaché à étudier l’impact de deux perturbateurs endocriniens suspectés, l’ibuprofène et le chlordécone, sur le programme d’expression du testicule fœtal humain. L’utilisation du RNA-seq m’a permis de définir et de comparer la signature toxicogénomique de chaque molécule afin de contribuer à la compréhension de leur mécanisme d’action et d’identifier les populations cellulaires affectées. Enfin, face à l’essor des technologies ultra-haut-débit dans les sciences de la vie, y compris dans les domaines de la reproduction, j’ai activement participé au déploiement d’une nouvelle version du Reprogenomic Viewer dans la dernière partie de ma thèse (http://rgv.genouest.org). Cet outil nternet a pour vocation de centraliser et de rendre accessibles les données de séquençage accumulées au sein de la communauté de la reproduction via des outils de visualisation intuitifs.
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Toxicologie
/ 18-07-2018
Rose Sophie
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Le foie joue un rôle prépondérant dans la biotransformation et l’élimination des xénobiotiques. Le développement de modèles cellulaires hépatiques humains pertinents représente un enjeu majeur afin d’étudier in vitro chez l’Homme la bioactivation de contaminants préoccupants, les altérations à l’ADN qui en dérivent et leur pouvoir mutagène/cancérigène. Ces analyses constituent des étapes clés pour l’identification de biomarqueurs d’exposition indispensables à l’évaluation du risque au niveau des individus et dans les populations. Lors de cette thèse, nous avons mis au point un modèle original de culture 3D en gels de collagène dans lequel les hépatocytes humains s’organisent en sphéroïdes polarisés. Par cette approche, nous avons démontré, pour la première fois, la capacité des hépatocytes primaires cultivés en 3D à proliférer in vitro. De plus, une réinitialisation du cycle cellulaire peut être obtenue après l’inhibition transitoire de la voie de signalisation des MAPKs MEK1/2-ERK1/2. Dans nos conditions, les hépatocytes primaires et transformés expriment des fonctions hépatiques hautement différenciées pendant plusieurs semaines de culture, et les cellules HepaRG se différencient après seulement quelques jours de culture, sans ajout de DMSO. Dans ce contexte, nous avons étudié la génotoxicité d’une classe de contaminants de l’environnement et de l’alimentation, les Amines Hétérocycliques Aromatiques (AHAs). Nos résultats démontrent la pertinence de la culture cellulaire en gels de collagène pour l’identification et la quantification des adduits à l’ADN et les études de toxicité aiguë et chronique dans les hépatocytes humains. Ces travaux représentent une avancée majeure car ils lèvent un verrou au développement de nombreuses applications biotechnologiques. L’établissement de tels modèles d’hépatocytes humains proliférants in vitro permet d’évaluer le pouvoir mutagène des contaminants de l’environnement.
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Toxicologie
/ 03-07-2018
Tête Arnaud
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La stéatose est la pathologie hépatique la plus répandue dans le monde, touchant environ 25 % de la population générale et jusqu’à 80 % des personnes en surpoids ou obèses. Cette maladie se traduisant par l’enrichissement des hépatocytes en triglycérides, est considérée comme bénigne. Cependant, environ 20 % des personnes atteintes de stéatose développent une stéatohépatite, pathologie caractérisée par une mort cellulaire et une inflammation et représentant un stade favorable au développement du carcinome hépatocellulaire. Les causes et mécanismes impliqués dans la progression de la stéatose vers la stéatohépatite sont encore à préciser. L’obésité, l’exposition aux contaminants environnementaux et la consommation d’alcool sont trois facteurs participant au développement des pathologies hépatiques. Pourtant, l’effet de l’interaction entre ces différents facteurs sur les pathologies hépatiques n’est pas connu. Dans ce contexte, cette thèse a eu pour objectif d’étudier l’impact d’une co-exposition au benzo[a]pyrène (B[a]P), un contaminant carcinogène environnemental, et à l’éthanol, utilisé à de faibles doses, sur les cellules hépatiques WIF-B9, présentant une stéatose préalable. Les résultats obtenus ont permis de démontrer qu’une telle exposition induit une progression de la stéatose hépatique vers un stade apparenté à une stéatohépatite, marquée par une augmentation de la mort cellulaire et de l’inflammation. Nous avons mis en évidence que la mort cellulaire résulterait de l’activation de p53 et d’une peroxydation lipidique. Une activation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques et une production de monoxyde d’azote sont à l’origine de ces évènements via une modification du métabolisme de l’éthanol et du B[a]P conduisant à des dommages à l’ADN dépendants de la formation d’anion peroxynitrite.
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Génétique, Génomique, Bioinformatique
/ 23-04-2018
Dagher Julien
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Le carcinome à cellules claires du rein (ccRCC) est une tumeur très hétérogène. Le taux de métastase est de l’ordre de 50% et les métastases des ccRCC sont peu fréquemment opérées. L’objectif de la thèse est d’une part d’analyser les facteurs prédictifs de métastases dans la tumeur primitive, et d’autre part de comparer le phénotype des tumeurs primitives et de leurs métastases dans le ccRCC par différentes approches histopathologiques et génomiques. Parmi les facteurs prédictifs de métastases, la nouvelle classification OMS/ISUP remplace l’ancienne classification de Fuhrman. L’intérêt pronostique de la nécrose tumorale est également mis en évidence. Une tumeur avec un grade donné associée à la présence de nécrose a un pronostic qui se rapproche d’une tumeur de grade plus élevé sans nécrose. Le pourcentage des cellules de grade 4 pourrait également contribuer à la stratification pronostique des patients. Une différence de survie avec un pronostic défavorable est observée pour les tumeurs dont le pourcentage des cellules de grade 4 est plus élevé (>50% vs. <10%). Au niveau moléculaire le statut du gène VHL, gène suppresseur de tumeur inactivé par un « double hit », est impliqué dans le pronostic des patients. Les ccRCC sans aucune altération de VHL sont des tumeurs plus agressives, qu’il convient d’isoler. Il existe une similarité morphologique et immunohistochimique entre les métastases et la composante de plus haut grade des tumeurs primitives correspondantes. Le profil chromosomique des métastases n’est pas totalement superposable à celui des tumeurs primitives. Il existe anomalies cytogénétiques récurrentes dans des métastases de ccRCC à des sites différents (+2p, +3q, +5, +8q, +12, +20). L’hétérogénéité tumorale retrouvée au niveau des tumeurs primitives est également retrouvée au niveau des métastases sous forme d’hétérogénéité inter- et intra-métastatique. L’analyse combinée des profils génomiques et transcriptomiques de 14 échantillons prélevés au sein d’un ccRCC primitif et de ses métastases ont permis d’identifier trois classes de clones tumoraux distincts, ne suivant aucune logique géographique. Enfin il semble exister un phénomène de multi-colonisation, qui implique non pas un, mais plusieurs clones tumoraux qui pourraient agir conjointement dans le processus métastatique.
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