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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 14-12-2018
Damodaran Arun Prasath
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Aurora-A est une sérine/thréonine kinase connue pour réguler les événements mitotiques dans les cellules. Sa surexpression dans les tumeurs favorise la survie cellulaire en modulant la prolifération cellulaire et en inhibant l’apoptose. Auparavant, il avait été montré qu'Aurora-A était important pour la stabilité d'une protéine riche en sérine / arginine (SR), ASF/SF2, modifiant ainsi l'épissage alternatif des gènes liés à l'apoptose. En cohérence avec ce rôle dans l'épissage, nous avons découvert que l'interactome d'Aurora-A contient un grand nombre de composants du spliceosome - des protéines spliceosomales centrales et non essentielles. Mon travail de thèse a consisté à caractériser la fonction de Aurora-A dans l'épissage pré-ARNm et à étudier sa fonction au niveau moléculaire. J’ai montré qu'Aurora-A interagissait directement avec des facteurs d'épissage, tels que les protéines SR et les protéines hnRNP, et phosphorylait également quelques-unes d'entre elles in vitro. J’ai démontré qu'Aurora-A est important pour la stabilité de ASF/SF2 et de nombreuses autres protéines SR. En utilisant la microscopie à immunofluorescence, j’ai démontré en outre qu'Aurora-A localise vers les taches nucléaires, les sites où les protéines d'épissage sont stockées, ainsi qu'à la périphérie des taches nucléaires où une majorité d'épissage de pré-ARNm est connue. L'ajout d'Aurora-A recombinant améliore notamment l'efficacité d'épissage du pré-ARNm de la bêta-globine in vitro. En analysant la méthode RNA-seq à l'aide de l'outil VAST, j'ai identifié 414 événements d'épissage alternatifs qui sont modifiés lors de l'inhibition de Aurora-A. De manière surprenante, les protéines kinases SR importantes, CLK1 et CLK4, sont également identifiées comme étant épissées de manière alternative d'une manière dépendante de Aurora-A. Dans l’ensemble, mes travaux révèlent le rôle important et novateur d’Aurora-A dans l’épissage des ARNm et suggèrent des voies moléculaires permettant à Aurora-A de moduler les facteurs d’épissage et d’épissage.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 05-07-2021
Sudevan Aswani
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Les interactions protéine-protéine (IPP) sont essentielles pour tous les processus physiologiques de la cellule. En raison de leur importance dans la signalisation et la régulation des fonctions cellulaires, une perturbation des IPPs peut entrainer des maladies comme le cancer ou des maladies neurodégénératives. Même si les IPPs sont généralement difficile à cibler, les progrès récents dans le domaine ont permis d’en faire cibles potentielles de médicaments. Mon projet de thèse vise à développer une plateforme de criblage chez la levure Saccharomyces cerevisiae pour faciliter l’étude et l’identification de modulateurs chimiques d’IPPs. Pour cela, nous avons utilisé un test de complémentation protéique appelé NanoLuc Binary Technology qui permet de sonder les IPP avec un grand niveau de sensibilité. La levure est un excellent organisme modèle pour le criblage à grande échelle compte tenu de la facilité de manipulation génétique et de son faible coût de production et de maintenance. Nous avons validé une cassette d’expression permettant de produire des paires de protéines humaines dans des cellules de levure à un niveau contrôlé. Ceci nous a permis de détecter des IPPs dans une grande gamme d’affinité et aussi de mesurer l'inhibition spécifique d’IPPs par des molécules chimiques. D’autre part, les conditions de criblage ont été optimisées pour obtenir une excellente reproductibilité intra- et inter-plaque (Z’ supérieur à 0,7). Des cribles pilotes ont été réalisés à l'aide de librairies de molécules chimiques et 3 paires de protéines - p53/MDM2, Ras/RafRBD et IFT46/IFT52 – afin d’évaluer la fiabilité et le comportement de cette plateforme en mode criblage. Un crible virtuel a également été réalisé en utilisant une base de données composée de millions de composés chimiques afin de rechercher des inhibiteurs potentiels des paires Ras/RafRBD et IFT46/IFT52. Bien qu’aucune des molécules identifiées par ces méthodes ne se soit avérée suffisamment spécifique pour envisager de poursuivre leur développement, ces travaux nous ont permis de valider l’efficacité de la plateforme que nous avons mis au point pour l’étude et la recherche de modulateurs d’IPPs.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 07-12-2022
Ryan Joseph
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La progression du cycle cellulaire est un processus essentiel dont la régulation est hautement conservée chez les eucaryotes. Les protéines kinases dépendantes des cyclines (Cdks) sont des composants clés du réseau de contrôle du cycle cellulaire et interagissent avec diverses cyclines pour conduire une prolifération cellulaire robuste. Un mécanisme de régulation de l'activité des Cdk, connu sous le nom de boucle de rétroaction Wee1/Cdc25, est hautement conservé dans les cellules eucaryotes et est essentiel dans les cellules de type sauvage. Nous avons précédemment démontré que les cellules MCN dépourvues des boucles de rétroaction Wee1/Cdc25 conservées (appelées MCN-AF) sont étonnamment viables. Cependant, les cellules MCN-AF présentent un taux de croissance significativement réduit. Après avoir réalisé une évolution expérimentale avec les cellules MCN-AF, nous avons identifié un certain nombre de mutations liées à une amélioration de la croissance en l'absence de la boucle de rétroaction Wee1/Cdc25. Spo12 est une petite protéine nucléaire de fonction inconnue, dont nous avons montré que, lorsqu'elle est perturbée, elle améliore la croissance des cellules MCN-AF et raccourcit la durée de la phase G1. En effet, je démontre que Spo12 joue un rôle dans une nouvelle boucle de rétroaction sur l'activité de la Cdk, qui, lorsqu'elle est perturbée, réduit l'activité globale de la Cdk au cours du cycle cellulaire. En outre, j'ai également adapté avec succès un pipeline d'analyse d'images automatisé pour permettre l'acquisition de données à haut débit à partir de laps de temps complexes de marqueurs du cycle cellulaire, ce qui constituera un outil utile pour la communauté des levures de fission. Enfin, j'ai également contribué au développement d'une méthodologie de mesure du volume en time-lapse, dans le cadre d'un projet plus large visant à mesurer avec précision le volume chez la levure de fission.
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Biologie
/ 26-06-2015
Blaszczak Ewa Katarzyna
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L'ubiquitylation des protéines est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle capital dans la régulation des nombreuses fonctions cellulaires, y compris la croissance cellulaire et la prolifération. Les dysfonctionnements de ce mécanisme sont à l'origine de diverses maladies telles que le cancer par exemple. Le processus d'ubiquitylation implique une série des réactions enzymatiques en cascade, catalysées par une famille des enzymes, structuralement très proches. Cette famille est composée des enzymes activateurs d'ubiquitine (E1s), des enzymes de conjugaison d'ubiquitine (E2s) et des ligases d'ubiquitine (E3s). Les interactions entre E2s et E3s sont dans le centre de la cascade d'ubiquitylation. Une combinaison particulière des pairs E2/E3 va déterminer le type de chaînes d'ubiquitine qui seront attachées à la protéine d'intérêt pour ensuite déterminer la fonction régulatrice de la voie d'ubiquitylation. A ce jour, seulement une petite fraction de paires possibles entre E2 et E3 a été investiguée par des approches biochimiques et in vitro. Cependant ces approches ne reflètent pas forcément des conditions qu'on trouve dans une cellule vivante. Prenant ceci en considération, les principales objectives de ma thèse seront comme suit : identifier et optimiser une méthode de détection et de quantification des interactions E2/E3 dans une cellule vivante de la levure de boulanger (Saccharomyces cerevisiae) ; construire une bibliothèque de souches de la levure qui permettrait d'établir des interactions entre E2 et E3 ; chercher de nouvelles potentielles paires E2/E3 ; caractériser fonctionnellement une potentielle paire E2/E2. Il est difficile de trouver une méthodologie appropriée afin d'étudier les interactions entre E2 et E3 parce qu'ils sont relativement faibles et transitoires. Leurs études nécessitent donc des techniques de détection avec une grande sensibilité. Parmi différentes techniques nous avons testé et choisi la complémentation bimoléculaire de la fluorescence, BiFC. Kurtosis, une mesure permettant localiser et quantifier la fluorescence BiFC-spécifique. Nos résultats nous nous avons permis à identifier 117 putatives paires E2/E3 parmi quels, 23 paires ont été déjà décrit dans la littérature. Parmi 94 nouvelles paires, certains E3s interagissent avec seulement une seule E2 ou d'autres donnent un signal BiFC avec plusieurs E2s. Ubc13, Ubc1 et Ubc4 sont les E2s qui interagissent le plus souvent. Nous avons identifié aussi une interaction entre les protéines Asi1 et Asi3 et les enzymes de conjugaison d'ubiquitine Ubc6 et Ubc7. Asi1 et 3 sont connus de former un complexe Asi1/3 sur la membrane intérieure du noyau impliqué dans la réponse de la cellule aux acides aminés extracellulaires. Ces protéines contiennent un domaine RING caractéristique pour les ligases d'ubiquitine mais cette activité n'était pas démontrée auparavant.
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Biologie
/ 10-03-2015
Gorrec Fabrice
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La cristallographie aux rayons X permet la détermination des structures tridimensionnelles de macromolécules biologiques ainsi que de leurs complexes à haute résolution. Cependant, la cristallisation des protéines est un phénomène totalement aléatoire et peu de cristaux sont généralement produits, de plus leur qualité et résistance sont souvent insuffisantes. Ces travaux visent à présenter les différentes étapes pour résoudre des structures de protéines ainsi que deux développements innovants pour formuler des solutions de criblage pour la cristallisation (appelés Pi et MORPHEUS).
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Génétique, génomique, bioinformatique
/ 19-01-2018
Lanteri Lilian
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La réplication de l’ADN est une étape essentielle du cycle cellulaire et les étapes qui la composent sont fortement conservées et régulées. Des erreurs dans la duplication du génome peuvent avoir de graves conséquences sur la proliferation cellulaire et ont été liées à différentes pathologies telles que le cancer. La duplication du génome commence à partir de sites distribués tout au long du génome appelés origines de réplication. Cette duplication est réalisé suivant un programme de réplication précis qui est défini, pour une population de cellules, par la distribution et l’activation de ses origines le long du génome. Toutefois, les cellules au sein d’une même population font preuve d’une certaine plasticité quant à l’utilisation de ces origines. Par exemple, l’ensemble des origines activées varie d’une phase S à une autre ainsi que d’une cellule à une autre. Bien que ces changements du programme de réplication aient été observés durant le développement, la différenciation cellulaire ainsi que dans les cancers, l’importance de ces changements sur les fonctions cellulaires reste peu caractérisée. En utilisant la levure à fission Schizosaccharomyces pombe comme modèle d’étude, notre laboratoire a montré que l’utilisation d’un programme de réplication particulier durant la phase S de méiose avait des conséquences sur la formation de cassures doubles brins de l’ADN. Ces résultats montrent pour la première fois qu’un changement du programme de réplication à l’échelle du génome a des conséquences sur les fonctions cellulaires. Basés sur ces résultats, mes travaux de thèse visent à comprendre le lien existant entre la replication du génome et la recombinaison méiotique, via deux approches. Dans un premier temps, nous avons exploré l’impact de l’organisation chromosomique sur la réplication de l’ADN et la recombinaison méiotique. Pour cela
nous avons généré des réarrangements chromosomiques qui nous ont permis d’échanger la position de domaines de réplication ayant des efficacités et des timings différents. Nos résultats ont montré que ces réarrangements induisaient des changements de l’efficacité des origines localisées spécifiquement de part et d’autre des extrémités des régions réarrangées, et ce durant les phases S mitotique et méiotique. Alors que l’analyse des cassures doubles brins de l’ADN sur l’ensemble du génome montre également des changements aux extrémités de la region réarrangée, ces changements ne reflètent pas les changements du programme de réplication. Ces résultats inattendus suggèrent que le contrôle des cassures doubles brins de l’ADN durant la méiose est régulé de manière complexe et que le context chromosomique pourrait jouer un rôle dans ce procédé. En parallèle, nous nous sommes intéressés à déterminer quelles étaient les étapes de la réplication de l’ADN importantes pour la formation des cassures doubles brins. Nous nous sommes spécialement concentrés à déterminer si la machinerie de réplication doit passer par un site de cassure avant que celle-ci soit faite ou si l’initiation de la réplication est suffisante pour induire les cassures doubles brins adjacentes. Pour cela nous avons construit et caractérisé un système dans lequel nous pouvons induire une barrière de réplication durant la phase S de méiose. Mes travaux de thèse ouvrent ainsi de nouvelles pistes de recherche pour comprendre le lien entre l’organisation chromosomique, la réplication de l’ADN et la recombinaison méiotique.
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Biochimie, biologie moléculaire et cellulaire
/ 28-10-2019
Diab Farah
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Le syndrome de Hallermann-Streiff (HSS) est un trouble du développement extrêmement rare qui se caractérise par un vieillissement prématuré, une microcéphalie, une microphtalmie, des cataractes congénitales, un nez en bec et une petite taille harmonieuse. Jusqu’à présent, aucune étude n’a pu mettre en évidence la survenue de cette pathologie ainsi quelles mutations intervenant dans l’apparition de HSS demeurent inconnues. Mon projet de thèse avait pour but de découvrir de nouveaux gènes chez des patients HSS n’ayant aucun défaut génétique connu. J’ai pu mettre en évidence quatre variants de novo dans les gènes COL3A1, MYH4, SUCNR1 et UGT2B4 chez un patient HSS et j’ai également détecté une mutation de novo dans le gène SCAF1 chez un autre patient. A l’exception de COL3A1, les gènes identifiés n’ont été associés à aucun défaut de développement et les variants retrouvés ont été prédits comme bénins par les outils in sillico. Cependant, il semble toutefois très probable que le variant de COL3A1 soit impliqué dans l’apparition de HSS, c’est pourquoi des recherches plus approfondies seront nécessaires pour confirmer sa pathogénicité. Récemment, des analyses de séquençage complet de l’exome ont révélé, chez quatre patients HSS non apparentés, les premiers variants candidats au niveau des gènes SMC2, SMC4, CHD6 et FAM111. Mon travail a eu pour but de prouver l’implication de ces gènes dans l’étiologie de HSS. J’ai démontré que ces gènes candidats étaient co-régulés aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. De plus, j’ai établi le fait que la plupart des gènes dérégulés dans HSS avaient un rôle dans des processus liés à l’ADN, dont la ségrégation des chromosomes sœurs et la réplication de l’ADN. Mes résultats obtenus au cours de ma thèse, renforcent fortement l’implication de ces gènes dans la pathologie ainsi que la probabilité que cette dernière soit liée à la chromatine. Par ailleurs, j’ai pu montr que la diminution de la longueur des télomères ainsi que des défauts de prolifération cellulaire étaient associés à HSS, en accord avec l’aspect progéroïde du syndrome. L’ensemble de mes résultats, ont permis de mettre en évidence et pour la première fois les dérégulations génétiques survenus chez tous les patients HSS ainsi que les mécanismes physiologiques pathogènes qui sont à l’origine de son apparition.
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Biologie
/ 18-10-2017
Lebeaupin Théo
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Pendant longtemps, la chromatine a été uniquement décrite comme un moyen de compacter près de deux mètres d’ADN dans un noyau de quelques micromètres de diamètre. On sait aujourd’hui que la chromatine représente en fait un élément majeur de régulation de toutes les fonctions nucléaires impliquant l’ADN. Dans le contexte de dommages de l’ADN induits par irradiations UV, la chromatine endommagée subit une décondensation rapide et transitoire qui l’amène à occuper un volume 1,5 fois plus grand que son volume initial. Cette relaxation chromatinienne est associée à une plus grande accessibilité de l’ADN. Néanmoins, le lien entre ces deux effets découlant de la présence de dommages, n’a pas été établi, ni caractérisé. En couplant l’imagerie de cellules vivantes à l’induction de dommages ciblés au sein de noyaux cellulaires par micro-irradiation laser, ces travaux ont permis de mettre en évidence le rôle majeur de PARP1 dans la réponse chromatinienne aux dommages de l’ADN. En effet, certaines conclusions contradictoires présentes dans la littérature scientifique concernant l’action de PARP1 sur la chromatine ont été réconciliées en démontrant que PARP1 seul peut se lier à la chromatine et entraîner une plus forte compaction de celle-ci, tandis que son activité catalytique de PARylation va, quant à elle, conduire à une décompaction de la structure chromatinienne. Cette étude s’est aussi intéressée à la dynamique particulière de l’histone H1 suite aux dommages de l’ADN. En effet, celui-ci est rapidement exclu des zones de dommages par un mécanisme encore inconnu, et les éléments apportés ici suggèrent que H1 pourrait jouer un rôle dans la décondensation de la chromatine suite aux dommages de l’ADN. Pour finir, des techniques de photo-perturbation et de spectroscopie de corrélation de fluorescence ont été employées pour comprendre et caractériser l’environnement moléculaire que constitue la chromatine endommagée et décondensée. Bien qu’une augmentation significative des interactions entre la chromatine et certains de ses partenaires d’interactions soit observée au sein des zones endommagées, aucun changement en termes d’encombrement moléculaire n’a pu être mis en évidence à ce niveau qui pourrait expliquer une plus grande accessibilité de l’ADN.
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Biologie
/ 14-12-2017
Babic Julien
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Connaître en temps réel la réponse et le comportement des cellules et organismes modèles suite à des changements de leur environnement, ou à des modulations de leurs fonctions biologiques est devenu essentiel dans les sciences du vivant. Ces réponses nous permettent ensuite de comprendre les mécanismes qui régissent le fonctionnement des cellules vivantes, avec des implications en recherche fondamentale, appliquée et biomédicale. Un des plus gros défis technologiques reste le contrôle des paramètres environnementaux en microscopie haute résolution. De nos jours, aucun système ne permet de réguler un ensemble complexe de paramètres de manière précise, dynamique et simultanée tout en observant les cellules dans leur environnement. L’objectif de ma thèse est de mettre au point un tel dispositif permettant a minima une régulation fine de la température, de la composition du milieu, et notamment de la concentration de divers drogues. Ce système doit être compatible avec les applications les plus poussées en microscopie photonique. Mon approche au cours de ma thèse pour élaborer un tel système est l’utilisation de la microfluidique. En effet, c’est la seule technologie qui puisse de réaliser un tel multiplexage. Elle permet de manipuler des petites quantités de fluide à travers un système contenant des canaux de dimensions allant du micromètre au centimètre. Cet ordre de grandeur des canaux constitue un atout majeur (réduction de la consommation des réactifs, réduction des couts, cinétiques des réactions chimiques et biologiques élevées, temps de diffusion court, etc.) et permet d’allier les expériences biologiques à la microscopie. Mon objectif est de concevoir une puce microfluidique qui représentera un pas technologique majeur et ouvrira de nouvelles possibilités de recherche.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 06-11-2023
Garcia Ruano Daniel
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La régulation du volume des cellules est un aspect crucial de la biologie des organismes vivants. Ainsi, la taille des cellules a un impact sur leur biochimie et leur organisation interne, et joue un rôle clé dans leur interaction avec l'environnement. De manière surprenante, alors que divers mécanismes contribuant à la régulation du volume cellulaire à court terme ont été décrits, le rôle de ce paramètre morphologique dans l'adaptation sur le long terme reste inconnu. Pour étudier cette question, nous avons optimisé de nouvelles méthodologies pour la mesure directe du volume cellulaire et l'évolution automatisée de la levure. Nous avons ensuite tiré parti de ces technologies pour réaliser des expériences d'évolution en laboratoire en soumettant des cellules de levure de fission à différentes conditions adverses. La plupart des populations évoluées que nous avons ainsi obtenues présentent des changements remarquables de volume cellulaire, changements qui sont associés à leur adaptation. Le séquençage du génome de l'une de ces populations, qui a évolué en présence de phénylalanine comme unique source suboptimale d'azote, a révélé des altérations génétiques adaptatives dans le facteur de transcription Toe2, le facteur de Nonsense Mediated Decay (NMD) Upf1, ainsi qu’une amplification génétique d’un gène codant pour un transporteur de spermidine, SPBC36.01c, dont l’expression est régulée par Toe2. Nous avons alors montré que la mutation de Toe2 et l'augmentation du nombre de copies de SPBC36.01c ont un effet synergique sur l’adaptation de cette population. Bien qu’un lien de causalité entre altération du volume cellulaire et évolution n'ait pas été observé, notre étude a mis en évidence un nouveau motif d’adaptation qui combine modulation transcriptionnelle et variation ciblée du nombre de copies d’un gène cible. Ce module pourrait être conservé et contribuer à l’évolution des cellules eucaryotes dans des environnements délétères variés.
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