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Auteur
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Cancérologie
/ 19-10-2018
Jakobczyk Hélène
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Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 09-11-2018
Guyomar Charlotte
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Le travail retranscrit dans cette thèse porte sur un processus biologique impliqué dans le contrôle qualité de la synthèse protéique bactérienne : la trans-traduction. Ce processus permet de libérer les ribosomes bloqués sur des ARNm défectueux tout en détruisant les peptides et ARNm problématiques impliqués dans le blocage. Il nécessite deux acteurs principaux qui interagissent avec le ribosome: l’ARN transfert-messager (ARNtm) et la protéine SmpB. Dans un premier chapitre, une étude en cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET) a permis d’obtenir deux structures à l’échelle atomique impliquant le ribosome et différents acteurs de la trans-traduction. La première structure met en évidence l’interaction entre la RNase R, enzyme responsable de la destruction des ARNm défectueux, et le ribosome bactérien. La deuxième structure a mené à la caractérisation des deux premiers états de la trans-traduction à une résolution quasi-atomique. De nouvelles interactions sont notamment observées entre la protéine SmpB et l’hélice H5 de l’ARNtm. Dans un second chapitre, la trans-traduction est exploitée comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. En effet, cette voie de sauvetage est souvent vitale ou alors indispensable à la virulence bactérienne. Dans l’objectif de découvrir de nouvelles molécules antibiotiques inhibant la trans-traduction, nous avons mis au point un système de détection de la trans-traduction in vitro. Ce système est simple et rapide, basé sur la mesure de la fluorescence d’une GFP tronquée, réassemblée par un ARNtm muté. La validation du système a conduit à la détection de nouveaux composés anti-trans-traduction.
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Microbiologie, Virologie, Parasitologie
/ 30-11-2018
Thomet Manon
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Les bactéries sont capables de vivre dans une grande variété d'environnements différents et sont confrontées à des conditions en constante évolution. Par conséquent, elles doivent rapidement adapter leur métabolisme en utilisant différentes régulations aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. Ces régulations sont largement étudiées et bien caractérisées. Cependant, les implications du ribosome sur la modulation de la traduction au cours de la réponse aux stress commencent à être explorées. Dans ce contexte de régulation ribosomique, l'hétérogénéité de la machinerie pourrait jouer un rôle important. En effet, le ribosome n'est pas une particule invariable et ses composants (ARNr, protéines ribosomiques) et leurs modifications peuvent varier. Les modifications des ARNr sont situées dans les sites fonctionnels du ribosome et sont particulièrement conservées, ce qui sous-entend leur potentielle importance. Cependant, leur rôle physiologique n'est pas toujours bien défini. Nous nous sommes intéressés aux méthylations de l'ARNr 16S et avons étudié leur rôle dans la traduction, dans des conditions favorables et stressantes. Nous avons démontré que l'absence de certaines méthylations augmente la traduction dans des conditions stressantes et non stressantes. Ainsi, les ribosomes modifiés peuvent jouer un rôle bénéfique lors de la réponse au stress. Une autre façon d'agir sur la traduction dans des conditions stressantes consiste à cibler les ARNm. C'est notamment le cas des toxines endoribonucléases qui sont spécifiquement produites lors de conditions stressantes. Ainsi, nous avons caractérisé le système toxine-antitoxine HicAB de Sinorhizobium meliloti. Nous prévoyons d’utiliser la toxine HicA afin d’étudier la réponse à son activité endoribonucléase chez les mutants ne possédant pas certaines modifications ribosomiques.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 14-12-2018
Damodaran Arun Prasath
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Aurora-A est une sérine/thréonine kinase connue pour réguler les événements mitotiques dans les cellules. Sa surexpression dans les tumeurs favorise la survie cellulaire en modulant la prolifération cellulaire et en inhibant l’apoptose. Auparavant, il avait été montré qu'Aurora-A était important pour la stabilité d'une protéine riche en sérine / arginine (SR), ASF/SF2, modifiant ainsi l'épissage alternatif des gènes liés à l'apoptose. En cohérence avec ce rôle dans l'épissage, nous avons découvert que l'interactome d'Aurora-A contient un grand nombre de composants du spliceosome - des protéines spliceosomales centrales et non essentielles. Mon travail de thèse a consisté à caractériser la fonction de Aurora-A dans l'épissage pré-ARNm et à étudier sa fonction au niveau moléculaire. J’ai montré qu'Aurora-A interagissait directement avec des facteurs d'épissage, tels que les protéines SR et les protéines hnRNP, et phosphorylait également quelques-unes d'entre elles in vitro. J’ai démontré qu'Aurora-A est important pour la stabilité de ASF/SF2 et de nombreuses autres protéines SR. En utilisant la microscopie à immunofluorescence, j’ai démontré en outre qu'Aurora-A localise vers les taches nucléaires, les sites où les protéines d'épissage sont stockées, ainsi qu'à la périphérie des taches nucléaires où une majorité d'épissage de pré-ARNm est connue. L'ajout d'Aurora-A recombinant améliore notamment l'efficacité d'épissage du pré-ARNm de la bêta-globine in vitro. En analysant la méthode RNA-seq à l'aide de l'outil VAST, j'ai identifié 414 événements d'épissage alternatifs qui sont modifiés lors de l'inhibition de Aurora-A. De manière surprenante, les protéines kinases SR importantes, CLK1 et CLK4, sont également identifiées comme étant épissées de manière alternative d'une manière dépendante de Aurora-A. Dans l’ensemble, mes travaux révèlent le rôle important et novateur d’Aurora-A dans l’épissage des ARNm et suggèrent des voies moléculaires permettant à Aurora-A de moduler les facteurs d’épissage et d’épissage.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 21-02-2019
Gomes Von Borowski Rafael
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Le biofilm confère aux bactéries de nombreux avantages en tant que matrice qui améliore leur résistance et tolérance aux antibiotiques. Staphylococcus epidermidis est l'une des bactéries cliniques les plus importantes en raison de sa capacité à former des biofilms sur des dispositifs médicaux, notamment les stimulateurs cardiaques, les cathéters urinaires et les prothèses. Dans ce contexte, les peptides ont été proposés comme une alternative importante, que ce soit en tant que traitement médicamenteux ou en tant qu’agents de surfaces anti-infectieux. Cette étude porte sur l’identification de nouveaux peptides naturels et synthetiques antibiofilm issus du piment Capsicum baccatum var. pendulum. Un peptide majeur responsable de l'activité antibiofilm contre S. epidermidis a été sélectionné et étudié de manière approfondie. Il agit par un nouveau mécanisme d'action que nous nommons « anti-assemblage de la matrice » (AAM). Dans le premier chapitre, nous décrivons le lien entre les peptides, les biofilms pathogènes et l'activité antibiofilm. Le chapitre 2 est consacré aux principaux résultats expérimentaux de cette thèse. Il intégre la caractérisation antibiofilm du peptide majeur, agissant par le nouveau mécanisme d'action AAM, indépendant de la régulation cellulaire. Des tests de cytotoxicité sont également présentés. Ces résultats nous ont permis de breveter le peptide en question, référencé au chapitre 3. Le dernier chapitre décrit la possible utilisation de peptidomimétiques antibiofilm en tant que perspective. La stratégie consiste à créer de petites molécules analogues à des peptides. Ces peptidomimétiques conservent les capacités inhérentes au peptide majeur, mais sont plus résistants aux protéases et/ou plus actifs.
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Biologie Cellulaire, Biologie du Développement
/ 22-03-2019
Le Boulch Marie
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L’ubiquitylation consiste en l’attachement covalent de l’ubiquitine sur d’autres protéines. Ce processus fait intervenir successivement trois familles d'enzymes : d’activation (E1s), de conjugaison (E2s) et de ligation (E3s) de l’ubiquitine. Lors de ma thèse, je m’intéresse au réseau d’enzymes d’ubiquitylation qui régule Cse4, l’histone variant localisée spécifiquement au centromère. Cse4 est une protéine essentielle qui permet une ségrégation correcte des chromosomes. Lorsqu’elle est trop exprimée, Cse4 peut se localiser sur la chromatine noncentromérique ce qui entraîne une instabilité génétique observée dans de nombreux cancers. Chez la levure, l’ubiquitylation empêche cette mauvaise localisation en menant à la dégradation de Cse4, mais les mécanismes précis ne sont pas connus et les données ont été obtenues en surexprimant Cse4. Notre hypothèse est que chez la levure, Cse4 endogène pourrait être régulée différemment grâce à plusieurs couples d’enzymes E2/E3. Dans ce contexte, l’objectif de ma thèse est de réaliser une étude détaillée du réseau d’enzymes impliqué dans l’ubiquitylation de Cse4 exprimée de façon endogène afin de mieux comprendre sa régulation. Nous avons pu notamment mettre en évidence une variation de l’ubiquitylation de Cse4 au cours de la phase S dépendant de l’E3 Psh1.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 01-10-2019
Sizaire Florian
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La surexpression d’Aurora A est un marquer majeur de certains cancers épithéliaux. Ce gène code pour la kinase multifonctionnelle Aurora A et son activation est requise pour l’entrée et la progression vers la mitose. Jusqu'à présent, aucun inhibiteur de cet oncogène n'a été approuvé par la FDA et il est donc primordial d'identifier de nouvelles molécules. Notre équipe a développé un biosenseur FRET (Forster Resonance Energy Transfer) pour l’activité kinase d’Aurora A, constitué de la kinase entière flanquée de deux fluorophores, une GFP et une mCherry. Le changement de conformation d’Aurora A lorsqu’elle est activée rapproche les fluorophores et augmente l’efficacité du FRET. Il est ainsi possible de suivre l’activation d’Aurora A dans les cellules vivantes exprimant le biosenseur à des niveaux endogènes. Nous pouvons mesurer le FRET en utilisant la technique de FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) grâce à un microscope développé dans l’équipe et appelé fastFLIM. Mes travaux de thèse ont consisté à développer une stratégie de criblage robuste et automatisée en combinant les capacités du fastFLIM et le biosenseur d’activité d’Aurora A. Cette stratégie basée sur une automatisation des acquisitions et de l’analyse de données a permis de cribler une banque de molécules en plaque 96 puits afin de trouver de potentielles inhibiteurs de l’activité kinase d’Aurora A. De plus, j’ai participé à la validation du biosenseur pour un suivi de l’activité kinase dans des cellules vivantes en montrant que les variations de FRET mesurées correspondent bien à l’état de phosphorylation d’Aurora A sur le résidu Thréonine 288, marqueur de son activation. Enfin, j’ai participé à l’élaboration de nouvelles techniques de microscopie pour suivre l’activité du biosenseur. Pour cela, j’ai utilisé un biosenseur de type homoFRET avec l’enjeu de pouvoir utiliser plusieurs biosenseurs dans un contexte multiplex. J’ai aussi utilisé la technique de 2c-FCCS (2-colors Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) sur le biosenseur Aurora A afin de pouvoir mesurer le FRET dans des régions où celui-ci est faiblement exprimant et dont la mesure de durée de vie de fluorescence n’est pas possible par le FLIM. Ainsi, mes travaux de thèse s’inscrivent dans la tendance à développer une microscopie quantitative et autonome avec comme enjeu d’apporter un grande nombre de données phénotypiques.
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Biochimie, biologie moléculaire et cellulaire
/ 10-10-2019
Gautron Arthur
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Résumé : Le mélanome est un cancer cutané très agressif caractérisé par une forte capacité métastatique. La forte plasticité des cellules de mélanome limite le potentiel thérapeutique des thérapies ciblées. En effet, malgré des taux de réponse élevés et une diminution du volume tumoral chez la majorité des patients, la quasi-totalité de ces derniers rechutent 6 à 12 mois après le début du traitement. Ces rechutes peuvent être causées par l’apparition de mutations oncogéniques mais également par la reprogrammation transcriptionnelle (plasticité) des cellules de mélanome au cours du traitement. En utilisant la technologie CRISPR-SAM (cribles gain de fonction à l’échelle du génome), nous avons identifié des gènes, dont SMAD3, impliqués dans la survie initiale des cellules de mélanome au cours du traitement ainsi que dans la reprise de la croissance tumorale, qui conduit les patients vers la rechute. Ces gènes constituent des cibles thérapeutiques dont l’inhibition pourrait permettre d’exploiter pleinement le potentiel des thérapies ciblées actuelles. Le deuxième objectif principal de cette thèse a été d’étudier plus spécifiquement les mécanismes participant à la plasticité des cellules de mélanome. Le facteur de transcription MITF est le régulateur central de ce mécanisme. Alors que sa régulation transcriptionnelle est très étudiée, sa régulation post-transcriptionnelle l’est beaucoup moins. Nous démontrons que la protéine de liaison aux ARN HuR régule positivement l’expression de MITF, participant ainsi à la plasticité des cellules de mélanome. L’ensemble de ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives sur la compréhension de la plasticité des cellules de mélanome, mécanisme à l’origine de l’agressivité caractéristique de ce cancer ainsi que de la résistance aux thérapies.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 21-10-2019
Métivier Mathieu
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La ségrégation des chromosomes requiert l’assemblage d’une structure dynamique appelée le fuseau mitotique qui est composé de microtubules. De nombreuses protéines appelées MAPs (Microtubule associated proteins) interagissent directement avec les microtubules afin de réguler leurs assemblages et leurs dynamiques. L’équipe a précédemment identifié de nouveaux candidats essentiels à l’assemblage du fuseau mitotique chez la drosophile. Au cours de ma thèse j’ai travaillé sur deux de ces protéines. Dans un premier temps, j’ai caractérisé la protéine dTBCE (Drosophila tubulin binding cofactor E) et son rôle dans la division cellulaire. Cette protéine fait partie d’un complexe nécessaire pour l’hétérodimérisation de la tubuline. Nous avons montré que dTBCE est essentielle afin de concentrer la tubuline dans la région du fuseau après la rupture de l'enveloppe nucléaire, ce qui permet la polymérisation des microtubules autour des chromosomes dans les cellules souches du système nerveux central de la drosophile, les neuroblastes (Nbs). J’ai également travaillé sur les différents domaines d’Ensconsine, une protéine essentielle qui contrôle la longueur du fuseau et la séparation des centrosomes dans les Nbs ainsi que le transport asymétrique dans les ovocytes de drosophile. Cette étude nous a permis de mettre en évidence une double régulation du recrutement de la kinésine-1 sur les microtubules.
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Cancérologie
/ 25-10-2019
Tardif Nina
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Le mélanome est la forme la plus mortelle de cancer cutané. La moitié des patients portent la mutation V600E de la kinase BRAF (BRAFV600E), activant de façon constitutive la voie de signalisation des MAPK impliquée dans la survie et la prolifération cellulaire. Les inhibiteurs de BRAF (BRAFi) ciblant spécifiquement la kinase mutée engendrent d’excellentes réponses chez les patients. Cette phase de réponse initiale est malheureusement suivie par le développement de mécanismes de résistance systématique conduisant à la rechute des patients. Il est aujourd’hui établi que l’hétérogénéité intratumorale et la plasticité phénotypique, c’est-à-dire la capacité des cellules tumorales à s’adapter au traitement, participent à l’émergence de cellules résistantes conduisant à la rechute. Ici, nous impliquons le facteur de transcription Aryl hydrocarbon Receptor (AhR) dans la modulation de la sensibilité ou la résistance des cellules de mélanomes aux BRAFi. Ainsi, les BRAFi sont des ligands d’AhR et l’activation non canonique du facteur de transcription par ces molécules permet l’expression d’un programme transcriptomique associé à la sensibilité des cellules aux BRAFi. À l’inverse, l’activation constitutive et canonique du facteur de transcription AhR dans les cellules de mélanome induit l’expression de gènes associés à l’acquisition de la résistance aux BRAFi. AhR participe également à l’acquisition du phénotype invasif/dédifférencié des cellules de mélanomes, associé à l’agressivité et à la résistance aux BRAFi. A l’inverse son inhibition, génétique (CRISPR-Cas9) ou chimique (antagoniste), permet de réengager les cellules vers un programme de sensibilité aux BRAFi. L’utilisation thérapeutique des antagonistes d’AhR tels les flavonoïdes, en combinaison avec les BRAFi, permet de potentialiser l’efficacité du traitement. La phase de réponse au traitement est donc allongée, limitant le développement des mécanismes de résistance in vitro et in vivo. Ainsi, AhR représente une nouvelle cible thérapeutique hautement intéressante. L’inhibition de son activité par l’utilisation d’un antagoniste, en combinaison avec les BRAFi actuellement utilisés, pourrait permettre chez les patients de retarder le développement des résistances et potentiellement la rechute.
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