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Biologie
/ 16-09-2016
Gillard Ghislain
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La polarité consiste en la ségrégation asymétrique de protéines, lipides ou organites au sein des cellules. Les cellules épithéliales sont un exemple de cellules hautement polarisées, avec un pôle apical, orienté vers l’extérieur, et un pôle basolatéral, orienté vers les tissus sous-jacents. Ces deux domaines sont séparés par des jonctions empêchant le passage des protéines d’un domaine à l’autre de la membrane. Par ailleurs, ces cellules organisent une polarité planaire in vivo, cruciale pour permettre différents processus morphogénétiques. La mise en place d’une telle organisation requiert la présence d’un trafic polarisé au sein des cellules pour adresser les différentes protéines au domaine adéquat de la membrane. Au cours de ma thèse j'ai étudié les mécanismes mis en place par le trafic intracellulaire pour permettre une telle organisation, avec pour modèle l’épiderme latéral du nématode Caenorhabditis elegans. D’une part, mes travaux de thèse ont mis en évidence dans les larves de nouveaux mécanismes de tri apico-basal d’une protéine essentielle pour la cohésion des tissus, la E-cadhérine. Ainsi, une première voie de tri impliquant le complexe adaptateur pour la clathrine AP-1, son interacteur physique SOAP-1 et la clathrine a été caractérisée. Un rôle pour la petite GTPase RAB-1 a également été mis en lumière dans ce processus. D’autre part, mes travaux ont mis en évidence un rôle pour cette petite GTPase RAB-1 dans l’organisation de la polarité planaire des cellules de l’épiderme au cours de la morphogenèse dans l’embryon. En effet, RAB-1 est requise pour localiser les protéines PAR spécifiquement au niveau des jonctions antéro-postérieures entre deux cellules et orienter le cytosquelette d’actine de manière perpendiculaire à l’axe antéro-postérieur. RAB-1 pourrait agir dans ce processus à trois niveaux : avec les protéines de polarité planaire Frizzled/MOM-5 et Dishevelled/DSH-2, via les phosphoinositides contrôlés par RAB-35 et OCLR-1 et/ou en régulant la tension générée à l'échelle du tissu.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 21-02-2019
Gomes Von Borowski Rafael
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Le biofilm confère aux bactéries de nombreux avantages en tant que matrice qui améliore leur résistance et tolérance aux antibiotiques. Staphylococcus epidermidis est l'une des bactéries cliniques les plus importantes en raison de sa capacité à former des biofilms sur des dispositifs médicaux, notamment les stimulateurs cardiaques, les cathéters urinaires et les prothèses. Dans ce contexte, les peptides ont été proposés comme une alternative importante, que ce soit en tant que traitement médicamenteux ou en tant qu’agents de surfaces anti-infectieux. Cette étude porte sur l’identification de nouveaux peptides naturels et synthetiques antibiofilm issus du piment Capsicum baccatum var. pendulum. Un peptide majeur responsable de l'activité antibiofilm contre S. epidermidis a été sélectionné et étudié de manière approfondie. Il agit par un nouveau mécanisme d'action que nous nommons « anti-assemblage de la matrice » (AAM). Dans le premier chapitre, nous décrivons le lien entre les peptides, les biofilms pathogènes et l'activité antibiofilm. Le chapitre 2 est consacré aux principaux résultats expérimentaux de cette thèse. Il intégre la caractérisation antibiofilm du peptide majeur, agissant par le nouveau mécanisme d'action AAM, indépendant de la régulation cellulaire. Des tests de cytotoxicité sont également présentés. Ces résultats nous ont permis de breveter le peptide en question, référencé au chapitre 3. Le dernier chapitre décrit la possible utilisation de peptidomimétiques antibiofilm en tant que perspective. La stratégie consiste à créer de petites molécules analogues à des peptides. Ces peptidomimétiques conservent les capacités inhérentes au peptide majeur, mais sont plus résistants aux protéases et/ou plus actifs.
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Biologie
/ 10-03-2015
Gorrec Fabrice
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La cristallographie aux rayons X permet la détermination des structures tridimensionnelles de macromolécules biologiques ainsi que de leurs complexes à haute résolution. Cependant, la cristallisation des protéines est un phénomène totalement aléatoire et peu de cristaux sont généralement produits, de plus leur qualité et résistance sont souvent insuffisantes. Ces travaux visent à présenter les différentes étapes pour résoudre des structures de protéines ainsi que deux développements innovants pour formuler des solutions de criblage pour la cristallisation (appelés Pi et MORPHEUS).
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Biologie
/ 20-06-2013
Guesdon Audrey
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Les microtubules (MTs) sont des constituants hautement dynamiques du cytosquelette, impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la division cellulaire ou le transport d'organites. Leur comportement dynamique est régulé par différents facteurs tels que les +TIPs, qui présentent la particularité de cibler les extrémités en croissance des MTs. Une de ces protéines, EB1, cible de façon autonome ces extrémités et y recrute un grand nombre d'autres +TIPs. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués dans cette reconnaissance restent imprécis. Afin de mettre en évidence une caractéristique structurale présente à l'extrémité des MTs en croissance et préférentiellement reconnue par EB1, nous avons utilisé deux approches de cryo-microscopie électronique. Nous avons tout d'abord utilisé une approche d'analyse par particules isolées, dans le but de comparer les reconstructions 3D de MTs assemblés en présence de GTP ou de GMPCPP, analogue lentement hydrolysable du GTP. Par la suite, nous avons utilisé la cryo-tomographie électronique couplée au marquage d'EB1 avec des nanoparticules d'or fonctionnalisées. Nos résultats nous permettent de proposer un modèle de ciblage impliquant une relocalisation de l'extrémité C-terminale d'EB1 lors de la fermeture des feuillets en tube. Cette relocalisation permettrait de recruter les autres +TIPs, et entraînerait une perte d'affinité d'EB1 pour la paroi des microtubules. La comparaison de ces résultats avec des études récentes effectuées par d'autres équipes, et concernant le rôle de l'hydrolyse du GTP dans la liaison d'EB1 avec les MTs, nous permet de proposer un modèle global incluant l'ensemble de ces données.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 09-11-2018
Guyomar Charlotte
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Le travail retranscrit dans cette thèse porte sur un processus biologique impliqué dans le contrôle qualité de la synthèse protéique bactérienne : la trans-traduction. Ce processus permet de libérer les ribosomes bloqués sur des ARNm défectueux tout en détruisant les peptides et ARNm problématiques impliqués dans le blocage. Il nécessite deux acteurs principaux qui interagissent avec le ribosome: l’ARN transfert-messager (ARNtm) et la protéine SmpB. Dans un premier chapitre, une étude en cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET) a permis d’obtenir deux structures à l’échelle atomique impliquant le ribosome et différents acteurs de la trans-traduction. La première structure met en évidence l’interaction entre la RNase R, enzyme responsable de la destruction des ARNm défectueux, et le ribosome bactérien. La deuxième structure a mené à la caractérisation des deux premiers états de la trans-traduction à une résolution quasi-atomique. De nouvelles interactions sont notamment observées entre la protéine SmpB et l’hélice H5 de l’ARNtm. Dans un second chapitre, la trans-traduction est exploitée comme cible pour le développement de nouveaux antibiotiques. En effet, cette voie de sauvetage est souvent vitale ou alors indispensable à la virulence bactérienne. Dans l’objectif de découvrir de nouvelles molécules antibiotiques inhibant la trans-traduction, nous avons mis au point un système de détection de la trans-traduction in vitro. Ce système est simple et rapide, basé sur la mesure de la fluorescence d’une GFP tronquée, réassemblée par un ARNtm muté. La validation du système a conduit à la détection de nouveaux composés anti-trans-traduction.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 29-11-2019
Hamdi-Rozé Houda
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L’holoprosencéphalie (HPE) est une pathologie du développement définie par un défaut de clivage du cerveau antérieur le long de la ligne médiane. Elle est caractérisée par une hétérogénéité phénotypique et une pénétrance incomplète. Le morphogène SHH est la principale molécule impliquée dans l’apparition de l’HPE. La voie NOTCH a été également impliquée dans l’apparition d'HPE chez les patients. Dans cette étude, j’ai montré que c’est en maintenant l’expression de Shh dans le cerveau ventral que NOTCH contribue à l’apparition de l’HPE. J’ai également montré que la voie NOTCH était impliquée dans la neurogenèse précoce au niveau de l’hypothalamus. Enfin, des mutants souris hypomorphes pour la voie SHH et la voie NOTCH présentent des anomalies discrètes de la ligne médiane correspondant à une dysplasie de la glande hypophysaire et une malformation de l’os basisphénoïde. Les mêmes anomalies sont observées chez les patients HPE. Ce travail nous a donc permis de générer un modèle animal reproduisant une forme d'HPE qui repose sur la double inactivation partielle de deux voies de signalisation moléculaire. Ce résultat renforce l'hypothèse d'une transmission multigénique pour cette pathologie complexe du développement de la ligne médiane.
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Biologie
/ 27-04-2016
Hascoët Pauline
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Le syndrome von Hippel Lindau (VHL) prédispose au développement de multiples tumeurs hautement vascularisées, telles que des hémangioblastomes rétiniens ou du système nerveux central, des phéochromocytomes et des carcinomes rénaux à cellules claires (CCRCC). Les patients atteints de ce syndrome sont porteurs d’une mutation du gène VHL. Ce gène, composé de trois exons, est transcrit en deux ARN messagers par épissage alternatif de l’exon 2. L’ARNm composé des 3 exons (variant #1) est la forme majoritairement exprimée par rapport à l’ARNm dépourvu de l’exon 2 (variant #2). Toutefois, une diminution du ratio variant #1/variant #2 a été essentiellement décrite dans deux situations : (i) dans les tissus embryonnaires humains et en particulier le rein, et (ii) dans certains CCRCC. Ces données suggèrent un rôle potentiel de ce variant #2 dans la tumorigenèse rénale. Deux protéines, pVHL213 et pVHL160, sont produites à partir du variant #1 et elles agissent comme suppresseurs de tumeur. Au début de ce travail, l’expression de l’isoforme protéique pVHL172 produite à partir du variant #2 restait à démontrer et sa fonction était inconnue. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont permis de mettre en évidence l’expression de pVHL172 dans des lignées cellulaires et dans des tissus tumoraux grâce à un nouvel anticorps monoclonal de souris dirigé contre les trois isoformes protéiques humaines de pVHL. Pour savoir si l’isoforme pVHL172 a un rôle de suppresseur de tumeur, des lignées cellulaires tumorales rénales exprimant stablement cette protéine ont été établies puis des expériences de xénogreffes de ces cellules chez la souris ont été réalisées. Non seulement pVHL172 n’inhibe pas la formation de tumeurs mais son expression induit un phénotype tumoral plus agressif avec une composante sarcomatoïde plus importante ainsi qu’une vascularisation immature plus conséquente que dans les tumeurs contrôles (n’exprimant pas pVHL). De plus, pVHL172 augmente l’expression des métalloprotéases de matrice MMP1 et MMP13, en partie via l’activation de la voie de signalisation Smad-dépendante du TGF-β. Par ailleurs, des partenaires protéiques de cette protéine ont été recherchés par une analyse protéomique différentielle. Les réseaux d’interaction réalisés à partir des protéines identifiées concernent entre autres la régulation de la matrice extracellulaire et le contrôle qualité des protéines. En conclusion, ce travail a montré que le gène VHL produit des isoformes protéiques avec des fonctions distinctes voire antagonistes, ce qui implique que la balance de leur expression influencerait la progression tumorale rénale. Chez certains patients, une augmentation de l’expression de pVHL172 pourrait être corrélée à une pathologie plus sévère. Ce travail montre l’intérêt de poursuivre l’étude des fonctions de cette protéine pour une meilleure compréhension de son implication dans le cancer du rein et dans la maladie VHL afin d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques.
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Biologie
/ 31-03-2017
Hatte Guillaume
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Les épithéliums agissent comme des barrières physiques et chimiques vitales pour l’organisme. Les fonctions épithéliales reposent sur la cohésion des cellules assurée par les jonctions serrées et adhérentes qui sont connectées au réseau d’acto-myosine. Pendant le développement et la vie adulte, les épithélia se développent ou se régénèrent grâce à la division cellulaire. Durant la division, les cellules épithéliales opèrent des changements importants de leurs formes sans que l’intégrité de l’épithélium soit altérée. Pendant la division, les forces de tensions appliquées sur la jonction adhérente et la force produite par l’anneau de cytodiérèse s’opposent ce qui contribue au maintien de l’intégrité de l’épithélium. Cependant les mécanismes impliqués dans la régulation des forces mises en jeu pendant la division cellulaire sont mal connus. Mon projet de thèse a été de caractériser la cytodiérèse des cellules épithéliales de vertébrés en utilisant l’embryon de Xenopus laevis comme modèle d’étude in situ. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré qu’un espace se forme de façon transitoire entre les deux cellules filles pendant la division. Cet espace est intimement lié à l’anneau de cytodiérèse. Dans la seconde partie, nous avons caractérisé l’implication de la jonction serrée pendant la division cellulaire. Nos résultats montrent que la protéine de structure ZO-1 et la protéine régulatrice GEF-H1 associées à cette jonction, régulent négativement les tensions appliquées sur la jonction adhérente. Le rôle actif de la jonction serrée dans cette régulation est supporté par l’activation de la voie de signalisation Rho/RockII/myosine et la régulation par GEF-H1 du trafic membranaire via le complexe exocyste. Grâce à un biosenseur de tension, nous avons montré que la force appliquée sur la jonction adhérente augmente dans les embryons déplétés de ZO-1 et GEF-H1. Cette augmentation des tensions induit le ralentissement de la division et la déformation de l’anneau contractile. Enfin, nos résultats suggèrent que GEF-H1 contrôlerait localement les tensions au site de division. Dans la dernière partie, nous avons étudié la formation et l’activation de l’anneau d’acto-myosine. Nos résultats non publiés montrent que le recrutement de plusieurs protéines de l’anneau commence en apical et progresse le long de la membrane latérale. Nous nous intéressons à présent à l’étude du rôle des jonctions apicales dans ce recrutement.
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Cancérologie
/ 19-10-2018
Jakobczyk Hélène
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Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes.
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Biologie et sciences de la santé
/ 03-10-2016
Kammerer-Jacquet Solène-Florence
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Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) est la tumeur du rein la plus fréquente. Il se caractérise par une inactivation fréquente du gène suppresseur de tumeur VHL retrouvée dans 70% des tumeurs conduisant à une transcription des gènes cibles du facteur de transcription HIF dont le VEGF. Il s’agit d’une tumeur agressive métastatique chez 50% des patients. Le sunitinib, un inhibiteur des récepteurs tyrosine kinase anti-angiogénique, est actuellement le plus utilisé en 1ère ligne malgré 30% des patients qui progressent rapidement. L’avènement d’un nouvel anti-angiogénique ciblant MET (cabozantinib) et d’immunomodulateurs (anticorps anti-PD-1, nivolumab) rend cruciale la découverte de facteurs prédictifs de réponse au traitement. Dans une première partie, nous avons étudié une série rétrospective de 98 ccRCC consécutifs pour lesquels nous souhaitions étudiés le statut VHL complet et le corréler à l’expression de PD-L1. De plus, alors que le pronostic est différent entre ccRCC métastatiques synchrones (d’emblée) et métachrones (à distance), leur phénotype n’avait jamais été comparé. Pour cela, nous avons effectué une analyse histologique des principaux facteurs pronostiques, immunohistochimique (CAIX, VEGF, PAR3, PD-1 et PD-L1) et moléculaire (statut complet VHL : délétion, mutation et méthylation du promoteur) corrélée à la survie spécifique. Nous avons démontré que le statut VHL non-inactivé (niVHL) était associé à la présence de métastases synchrones, une composante sarcomatoïde, un infiltrat lymphocytaire dense, une surexpression de VEGF, une expression de PD-L1 et à un mauvais pronostic. Nous avons aussi comparé les phénotypes des ccRCC métastatiques métachrones et synchrones. Ces derniers étaient associés à une composante sarcomatoïde, une expression cytoplasmique de PAR-3, une surexpression de VEGFA, un statut niVHL et à un mauvais pronostic depuis le diagnostic des métastases. Dans une deuxième partie, nous avons étudié une série rétrospective de 90 ccRCC métastatiques consécutifs traités par sunitinib en première ligne afin d’identifier des facteurs prédictifs de réponse ou de résistance. Nous avons utilisé les mêmes techniques que précédemment avec en plus le statut MET (mutation en NGS et expression en IHC). Les patients ont été classés en résistants primaires, intermédiaires et longs répondeurs en fonction de la durée de leur réponse évaluée par des critères radiologiques (RECIST). Nous avons aussi caractérisé le profil génétique de 73 ccRCC de cette série par CGH array pour lesquels nous disposions de congélation. Les patients résistants primaires avaient plus souvent un mauvais pronostic (score de Heng), des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire. Sur le plan cytogénétique, leurs tumeurs présentaient des altérations génétiques plus nombreuses tant au niveau des gains que des pertes. Parmi ces altérations récurrentes, étaient décrites les gains du 5p, 7p, 8q22.1-qter et la perte de la région 6q21-q25.3. Le modèle de Cox multivarié mettait en évidence 4 facteurs indépendants : le score de Heng, des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire et le gain du 8q qui intégrés dans un nomogramme pronostique avaient un c-index de 0.74 et 0.77 pour la survie sans progression et la survie globale. En conclusion, notre étude a permis d’identifier un sous-type de ccRCC avec un statut niVHL de mauvais pronostic qu’il conviendrait d’étudier de manière plus approfondie sur le plan génomique. De plus, nous avons montré une différence de phénotype entre les ccRCC des patients métastatiques synchrones et métachrones alors que leur prise en charge est actuellement équivalente. Enfin nous avons mis en évidence un nomogramme pronostique dans les ccRCC métastatiques traités par sunitinib en 1ère line. Ce nomogramme s’il est confirmé par une étude prospective plus large pourrait avoir un impact clinique important dans la sélection des patients les plus à même de bénéficier des anti-angiogéniques.
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