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Approche biophysique du vivant
/ 07-12-2022
D’Augustin de Bourguisson Ostiane
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L’ADN est constamment soumis à de nombreux stress, menaçant son intégrité et, par conséquent, le bon fonctionnement cellulaire. Pour y faire face, la cellule dispose de tout un arsenal de voies de réparation. L’une des altération du génome les plus fréquentes est l’oxydation de la guanine en 8-oxoguanine (8-oxoG). La 8-oxoG possède un fort potentiel mutagène du fait de son appariement préférentiel avec l’adénine au lieu de la cytosine lors de la réplication. Ainsi, elle doit être détectée et réparée à temps pour éviter la fixation dans le génome de mutation par transversion G:C vers T:A. Cette lésion appairée à une cytosine est détectée et excisée par la 8-oxoguanine ADN-glycosylase (OGG1), ce qui initie la réparation par excision de base. Si le fonctionnement d’OGG1 a été largement étudié in vitro et que de nombreuses données structurales sont disponibles, très peu d’études se sont penchées sur la dynamique de cette protéine au sein du noyau cellulaire. Le but de ma thèse était donc de caractériser la dynamique de recherche de la 8-oxoG par OGG1 et d’identifier les éléments (résidus ou fonctions) régulant cette dynamique. Ainsi, j’ai pu montrer que l’interaction avec l’ADN était un élément majeur de la recherche de la 8-oxoG par OGG1, et que muter les résidus impliqués dans l’interaction avec l’ADN perturbait la dynamique d’OGG1 et sa capacité à trouver et exciser la 8-oxoG. De même, la reconnaissance de la 8-oxoG, mais également celle de la cytosine lui faisant face, jouent toutes deux un rôle important dans le fonctionnement de l’ADN-glycosylase et son recrutement à la zone de dommages. Enfin, le motif NNN, très conservé mais très peu caractérisé jusqu’ici semble être essentiel à l’association spécifique avec la 8-oxoG mais pas à la dynamique de recherche.
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Biologie
/ 23-04-2014
Gallaud Emmanuel
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La mitose est une étape essentielle du cycle cellulaire à l’issue de laquelle le génome répliqué de la cellule mère est ségrégé de façon équitable entre les deux cellules filles. Pour cela, la cellule assemble une structure hautement dynamique et composée de microtubules, appelée le fuseau mitotique. En plus d’assurer la bonne ségrégation des chromosomes, le fuseau mitotique détermine l’axe de division, un phénomène particulièrement important pour la division asymétrique où des déterminants d’identité cellulaire doivent être distribués de façon inéquitable entre les deux cellules filles. L’assemblage et la dynamique de ce fuseau sont finement régulés par de nombreuses protéines qui sont associées aux microtubules. Au cour de ma thèse, nous avons identifié 855 protéines constituant l’interactome des microtubules de l’embryon de Drosophile par spectrométrie de masse puis criblé par ARNi 96 gènes peu caractérisés pour un rôle en mitose dans le système nerveux central larvaire. Par cette approche, nous avons identifié 18 candidats sur la base de leur interaction aux microtubules et de leur phénotype mitotique, dont Ensconsine/MAP7. Nous avons montré qu’Ensconsine est capable de s’associer aux microtubules du fuseau et favorise leur polymérisation. De plus, les neuroblastes des larves mutantes présentent des fuseaux raccourcis et une durée de mitose prolongée. Ce délai en mitose est dû à une activation prolongée du point de contrôle du fuseau mitotique qui est essentiel pour une ségrégation correcte des chromosomes en l’absence d’Ensconsine. D’autres part, en association avec la Kinésine-1, son partenaire fonctionnel en interphase, nous avons montré qu’Ensconsine est également impliquée dans la séparation des centrosomes au cours de l’interphase. Ceci entraine une distribution aléatoire des centrosomes pères et fils dans cellules filles. Grâce à cette étude, nous avons révélé deux nouvelles fonctions pour Ensconsine : elle favorise la polymérisation des microtubules et participe donc à l’assemblage du fuseau mitotique et est impliquée, avec la Kinésine-1 dans la dynamique des centrosomes.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 02-07-2021
Lejart Audrey
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La chromatine, composée d’ADN et de protéines histones, possède une structure multi-échelle complexe et dynamique participant notamment à la régulation de la transcription. Son état de compaction peut être régulé par des modifications épigénétiques trouvées sur la queue des histones et sur l’ADN. Les enzymes Ten-eleven translocation (TET) sont responsables de l’oxydation des 5-methylcytosines. Parmi les formes oxydées, l’accumulation de la 5-hydroxyméthylcytosine au sein de régions régulatrices géniques est associée à l’activation de la transcription et à un état ouvert de la chromatine. Outre leur activité catalytique, les protéines TET sont aussi impliquées dans le recrutement de facteurs de remodelage chromatinien. Les protéines TET participent donc à la régulation de la structure chromatinienne via différents mécanismes qui restent cependant à être mieux caractérisés. En analysant l’état de structuration de la chromatine en microscopie confocale et électronique, j’ai pu démontrer qu’indépendamment de l’activité enzymatique de TET1, la surexpression de la région N-terminale de TET1 dans les cellules humaines est responsable d’une réorganisation chromatinienne aboutissant à une démixion entre phase chromatinienne et nucléoplasme. Cette réorganisation est aussi associée à une modification de la dynamique d’échange des histones au niveau du nucléosome. Au niveau fonctionnel, le remodelage chromatinien induit par le domaine N-terminal de TET1 est associé à un enrichissement d’une marque d’histone répressive, H3K27me3 et une diminution globale du niveau transcriptionnel. L’ensemble de ces données suggère que le domaine N-terminal de TET1, pourrait participer à la régulation de la transcription via son rôle dans le remodelage de la structure chromatinienne.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 21-10-2019
Métivier Mathieu
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La ségrégation des chromosomes requiert l’assemblage d’une structure dynamique appelée le fuseau mitotique qui est composé de microtubules. De nombreuses protéines appelées MAPs (Microtubule associated proteins) interagissent directement avec les microtubules afin de réguler leurs assemblages et leurs dynamiques. L’équipe a précédemment identifié de nouveaux candidats essentiels à l’assemblage du fuseau mitotique chez la drosophile. Au cours de ma thèse j’ai travaillé sur deux de ces protéines. Dans un premier temps, j’ai caractérisé la protéine dTBCE (Drosophila tubulin binding cofactor E) et son rôle dans la division cellulaire. Cette protéine fait partie d’un complexe nécessaire pour l’hétérodimérisation de la tubuline. Nous avons montré que dTBCE est essentielle afin de concentrer la tubuline dans la région du fuseau après la rupture de l'enveloppe nucléaire, ce qui permet la polymérisation des microtubules autour des chromosomes dans les cellules souches du système nerveux central de la drosophile, les neuroblastes (Nbs). J’ai également travaillé sur les différents domaines d’Ensconsine, une protéine essentielle qui contrôle la longueur du fuseau et la séparation des centrosomes dans les Nbs ainsi que le transport asymétrique dans les ovocytes de drosophile. Cette étude nous a permis de mettre en évidence une double régulation du recrutement de la kinésine-1 sur les microtubules.
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Biologie
/ 22-12-2016
Ulvé Ronan
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Les lymphomes sont des cancers parmi les plus fréquents chez l’Homme et le chien. Ils présentent de fortes homologies du point de vue clinique, histologique et de la réponse aux traitements. Dans le contexte actuel, les méthodes de séquençage de nouvelles générations (NGS) permettent l’identification de nombreuses altérations génétiques nécessaires pour le diagnostic, le pronostic et le développement de thérapies ciblées. Pourtant, le développement de nouvelles molécules rencontre une forte proportion d’échec lors des études cliniques. Ce constat est en partie dû à l’utilisation de modèles non représentatifs de la maladie telle qu’elle se présente chez l’Homme. Chez le chien, la sélection artificielle imposée par l’homme fait qu’aujourd’hui, de nombreuses races présentent des prédispositions aux lymphomes et même à certains sous-types. Cette caractéristique fait du chien un modèle spontané pertinent aussi bien pour l’étude des bases génétiques des lymphomes que pour le développement de nouvelles molécules pour l’Homme via des essais cliniques vétérinaires. Mon travail de thèse a consisté à caractériser génétiquement les lymphomes canins pour proposer des modèles prédictifs des lymphomes homologues humains. Suite à une étape de collecte d’un grand nombre de prélèvements de chiens atteints de lymphomes, j’ai travaillé sur l’amélioration d’un test de diagnostic des sous-types B ou T de lymphomes basé sur la technique d’amplification appelé PARR. J’ai également montré une transmission familiale de lymphomes chez le Bouvier bernois, ce qui m’a permis d’effectuer une étude d’association génétique (GWAS) comportant 63 chiens atteints et 167 indemnes. J’ai pu ainsi identifier plusieurs loci sur les chromosomes 9, 15 et 23, ce dernier incluant le gène MYD88 connu pour être impliqué dans les lymphomes humains. J’ai également découvert par différentes approches NGS (RNA-Seq et Capture ciblée) des altérations génétiques récurrentes partagées entre l’Homme et le chien. Parmi celles-ci, j’ai identifié des fusions de gènes entre des immunoglobulines et les cyclines D : 3 cas pour CCND3 et 1 cas pour CCND1. J’ai également retrouvé la forte récurrence d’altérations impliquant les oncogènes KDR, MYC ou UBR5 ainsi que les gènes suppresseurs de tumeur POT1, PTEN ou TP53. Ces évènements étant associés chez l’Homme à des lymphomes agressifs ou résistants aux traitements, les lymphomes canins présentent donc un intérêt majeur en tant que modèle spontané. Enfin, j’ai mis en place des essais de molécules in vitro, réalisables à partir de la lignée CLBL-1 ou de cultures primaires caractérisées par NGS. Cette étape préliminaire permet d’envisager des essais cliniques vétérinaires avec des chiens de propriétaire, atteints de lymphomes. Cette démarche s’intègre dans le concept « One health » dont l’objectif est de faire bénéficier ces recherches à la médecine humaine et vétérinaire.
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Biologie et sciences de la santé
/ 03-10-2016
Kammerer-Jacquet Solène-Florence
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Le carcinome rénal à cellules claires (ccRCC) est la tumeur du rein la plus fréquente. Il se caractérise par une inactivation fréquente du gène suppresseur de tumeur VHL retrouvée dans 70% des tumeurs conduisant à une transcription des gènes cibles du facteur de transcription HIF dont le VEGF. Il s’agit d’une tumeur agressive métastatique chez 50% des patients. Le sunitinib, un inhibiteur des récepteurs tyrosine kinase anti-angiogénique, est actuellement le plus utilisé en 1ère ligne malgré 30% des patients qui progressent rapidement. L’avènement d’un nouvel anti-angiogénique ciblant MET (cabozantinib) et d’immunomodulateurs (anticorps anti-PD-1, nivolumab) rend cruciale la découverte de facteurs prédictifs de réponse au traitement. Dans une première partie, nous avons étudié une série rétrospective de 98 ccRCC consécutifs pour lesquels nous souhaitions étudiés le statut VHL complet et le corréler à l’expression de PD-L1. De plus, alors que le pronostic est différent entre ccRCC métastatiques synchrones (d’emblée) et métachrones (à distance), leur phénotype n’avait jamais été comparé. Pour cela, nous avons effectué une analyse histologique des principaux facteurs pronostiques, immunohistochimique (CAIX, VEGF, PAR3, PD-1 et PD-L1) et moléculaire (statut complet VHL : délétion, mutation et méthylation du promoteur) corrélée à la survie spécifique. Nous avons démontré que le statut VHL non-inactivé (niVHL) était associé à la présence de métastases synchrones, une composante sarcomatoïde, un infiltrat lymphocytaire dense, une surexpression de VEGF, une expression de PD-L1 et à un mauvais pronostic. Nous avons aussi comparé les phénotypes des ccRCC métastatiques métachrones et synchrones. Ces derniers étaient associés à une composante sarcomatoïde, une expression cytoplasmique de PAR-3, une surexpression de VEGFA, un statut niVHL et à un mauvais pronostic depuis le diagnostic des métastases. Dans une deuxième partie, nous avons étudié une série rétrospective de 90 ccRCC métastatiques consécutifs traités par sunitinib en première ligne afin d’identifier des facteurs prédictifs de réponse ou de résistance. Nous avons utilisé les mêmes techniques que précédemment avec en plus le statut MET (mutation en NGS et expression en IHC). Les patients ont été classés en résistants primaires, intermédiaires et longs répondeurs en fonction de la durée de leur réponse évaluée par des critères radiologiques (RECIST). Nous avons aussi caractérisé le profil génétique de 73 ccRCC de cette série par CGH array pour lesquels nous disposions de congélation. Les patients résistants primaires avaient plus souvent un mauvais pronostic (score de Heng), des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire. Sur le plan cytogénétique, leurs tumeurs présentaient des altérations génétiques plus nombreuses tant au niveau des gains que des pertes. Parmi ces altérations récurrentes, étaient décrites les gains du 5p, 7p, 8q22.1-qter et la perte de la région 6q21-q25.3. Le modèle de Cox multivarié mettait en évidence 4 facteurs indépendants : le score de Heng, des métastases hépatiques, une infiltration de la graisse hilaire et le gain du 8q qui intégrés dans un nomogramme pronostique avaient un c-index de 0.74 et 0.77 pour la survie sans progression et la survie globale. En conclusion, notre étude a permis d’identifier un sous-type de ccRCC avec un statut niVHL de mauvais pronostic qu’il conviendrait d’étudier de manière plus approfondie sur le plan génomique. De plus, nous avons montré une différence de phénotype entre les ccRCC des patients métastatiques synchrones et métachrones alors que leur prise en charge est actuellement équivalente. Enfin nous avons mis en évidence un nomogramme pronostique dans les ccRCC métastatiques traités par sunitinib en 1ère line. Ce nomogramme s’il est confirmé par une étude prospective plus large pourrait avoir un impact clinique important dans la sélection des patients les plus à même de bénéficier des anti-angiogéniques.
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Biologie
/ 15-12-2014
Schirmer Claire
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Les maladies dites ''conformationnelles'' sont caractérisées par un mauvais repliement des protéines qui, de ce fait, ne peuvent plus assurer leur fonction biologique. C'est le cas des amyloses, ces pathologies impliquent des protéines ayant la capacité de s'agréger pour former des structures spécifiques appelées « fibres amyloïdes ». Aujourd'hui, une trentaine de protéines humaines sont connues pour former ce type de fibres et notamment la protéine tau. Celle-ci est associée à plusieurs maladies neurodégénératives, regroupées sous le terme de « tauopathies », incluant la maladie d'Alzheimer. En conditions physiologiques, tau est associée aux microtubules et régule leur polymérisation. Dans les tauopathies, elle devient hyperphosphorylée et s'agrège dans les neurones sous forme de neurodégénérescences fibrillaires (NFTs) toxiques. Les protéines chaperons et particulièrement la protéine de choc thermique de 90 kDa, Hsp90, régule l'homéostasie de la protéine tau. L'interaction entre tau et Hsp90 implique différentes régions de la protéine tau dont celle contenant un hexapeptide de séquence VQIVYK. Ce court fragment est nécessaire et suffisant pour induire la fibrillation de la protéine tau entière in vivo. Cet hexapeptide est également capable, à lui seul, de former des fibres amyloïdes, in vitro, comparables à celles retrouvées in vivo. Nous avons donc choisi d'utiliser l'hexapeptide VQIVYK comme modèle d'étude de la fibrillation, in vitro, et testé l'effet de Hsp90 sur les processus agrégatifs du peptide. Nous avons démontré que Hsp90 interagit spécifiquement avec les structures amyloïdes formées par le peptide et qu'elle est capable d'inhiber à la fois la polymérisation et la dépolymérisation des fibres. Ce rôle antagoniste joué par Hsp90 permet la stabilisation d'espèces amyloïdes intermédiaires supposées moins neurotoxiques. Ces résultats confirment l'implication de Hsp90 dans les processus agrégatifs de la protéine tau et ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques contre les pathologies neurodégénératives. De plus, cette étude apporte des éléments de réponse sur le fonctionnement des chaperons moléculaires vis-à-vis de leur protéine cliente.
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Informatique
/ 22-01-2021
Balluet Mael
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Les systèmes de microscopie optique sont des outils complexes, indispensables à la compréhension du vivant par la recherche fondamentale et appliquée en biologie, dont l'automatisation est un champ d'étude en plein essor. Nous présentons dans cette thèse la conception d'un prototype de système embarqué analysant des images de microscopie en temps-réel et réalisant une boucle de rétroaction avec un microscope. Sa confrontation avec des applications biologiques théoriques nous a permis d'obtenir un modèle théorique générique et modulaire, dont nous avons entamé le test en conditions réelles. Il permet de modifier des modalités d'acquisition d'images d'un microscope en fonction des images analysées à la volée. De plus, il effectue un tri de ces images en ne retournant que celles représentant des objets d'intérêt pour les biologistes. L’analyse des images en temps-réel, nécessitant des classifications précises et rapides. Nous proposons une méthode d'optimisation d'un outil générique de classification d'images, dont nous identifions les caractéristiques pertinentes avec un faible temps d’extraction. Nous avons mis en évidence une redondance des caractéristiques qui permet d’exclure les plus longues à calculer même si ce sont les plus discriminantes. Ainsi, une dizaine de caractéristiques permet de classer 14 cellules par seconde avec une précision supérieure à 80 % avec une Random Forest ou un réseau de neurones. Ces travaux ouvrent des perspectives d’optimisation des systèmes de classification en apprentissage automatique, y compris profond. En conclusion, nous avons mis en place les bases d’un microscope intelligent et autonome, ouvrant la voie à une nouvelle génération de microscopie, contribuant à l’émergence d’une médecine de précision.
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Biologie
/ 16-10-2014
Loyer Nicolas
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L'intérieur des cellules eucaryotes est compartimenté en organites qui échangent des lipides et protéines entre eux et avec la membrane plasmique via le trafic vésiculaire. Dans les cellules polarisées comme les cellules épithéliales, dont la membrane plasmique est divisée en un pôle apical et un pôle basolatéral séparés par une ceinture de jonctions, le trafic vésiculaire est contrôlé par des systèmes de tri polarisé, permettant d'adresser les protéines appropriées au domaine membranaire approprié. Dans ces cellules épithéliales, le complexe adaptateur AP-1 contrôle l'adressage au pôle basolatéral et le trafic de la molécule d'adhésion E-Cadhérine, une protéine transmembranaire des jonctions d'adhérence. Il a de plus été démontré dans les cellules intestinales du nématode C. elegans et des mammifères qu'AP-1 est nécessaire au maintien de la polarité épithélial. J'ai étudié ces fonctions d'AP-1 chez l'organisme modèle Drosophila melanogaster. J'ai montré qu'AP-1 contrôle aussi le trafic de E-Cadhérine chez la Drosophile mais n'est pas requis pour la maintenance de la polarité de l'épithélium folliculaire, un épithélium entourant le cyste germinal femelle de 16 cellules au cours de l'ovogénèse chez la Drosophile. Ces expériences dans ce tissu m'ont amené à découvrir une nouvelle fonction de E-Cadhérine dans le cyste germinal. Les cellules de ce cyste sont connectées entre elles par des ponts cytoplasmiques stabilisés à l'issue de cytocinèses incomplètes. J'ai montré que les cellules du cyste mutantes pour AP-1 présentent un phénotype de multinucléation dû au décrochage des ponts cytoplasmiques. Ce phénotype corrèle avec un défaut d'adressage de E-Cadhérine dépendant d'AP-1 à la membrane plasmique entourant ces ponts, via les endosomes de recyclage. E-Cadhérine y est nécessaire pour leur ancrage à la membrane plasmique, un rôle qui avait été jusque-là masqué par l'expression ectopique compensatoire de N-Cadhérine dans les mutants E-Cadhérine. Ce rôle d'E-Cadhérine passe par l'organisation de protrusions membranaires présentant l'aspect et contenant certains marqueurs protéiques des microvillosités observées au pôle apical des cellules épithéliales.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 06-07-2023
Duclos Maela
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Le trafic intracellulaire contrôle la polarité cellulaire intestinale, dont la mise en place et le maintien sont essentiels à la fonction de cet organe. De façon surprenante, la déplétion de la sous-unité μ1B de l’adaptateur de clathrine AP-1B (Ap1m2), impliquée dans le tri polarisé, entraîne des défauts de polarité et une hyperplasie des cryptes dans l’intestin de souris, révélant un nouveau rôle du trafic polarisé dans le contrôle de la prolifération intestinale. Nous avons confirmé les défauts de polarité et l’hyper-prolifération dans un modèle murin d’organoïde intestinal muté pour Ap1m2. L’hyper-prolifération observée est dépendante des voies de signalisation EGFR et mTOR. L’analyse phénotypique révèle également des défauts de différenciation du lignage sécrétoire et une expansion de la zone des cellules souches/progénitrices.De plus, nous avons montré que la localisation du déterminant de polarité apicale, CDC42, est altérée dans les organoïdes mutés pour Ap1m2. La déplétion intestinale de CDC42 induisant des phénotypes similaires à ceux que nous observons, nous émettons l’hypothèse qu’AP-1B régule la prolifération à travers le contrôle de la localisation de CDC42. Nous avons donc montré qu’AP-1B joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la couche épithéliale en contrôlant la polarité cellulaire, mais aussi la prolifération et la différenciation intestinale. Des travaux complémentaires permettront de caractériser les mécanismes par lesquels AP-1B contrôle la localisation de CDC42 et l’activation des voies de signalisation EGFR et mTOR.
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