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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 28-09-2022
Boukthir Sarrah
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Streptococcus pyogenes (SGA), pathogène strictement humain, est responsable d’un large panel d’infections et de 500000 décès/an. Son épidémiologie complexe rend la vaccination difficile à ce jour, soulignant l’importance de l’étude de sa physiopathologie. Le recueil exhaustif et prospectif de 1000 souches cliniques de SGA (2009-2017, Bretagne) a permis d’étudier sa dynamique évolutive et de décrire trois profils épidémiologiques: prévalents, sporadiques et émergents. Un phénomène singulier a également été observé: l’isolement de génotypes sporadiques/ émergents en l’absence de circulation de génotypes prévalents au sein du même emm-cluster. De plus, aucune souche emm3 n’a été isolée au cours de deux années consécutives, l’analyse génomique d’une souche non invasive a montré une délétion au sein du gène grab (protéine GRAB). Le séquençage du gène grab des souches emm3, a mis en évidence 6 profils protéiques: 3 structures ayant une substitution non-synonyme, et 3 avec au moins une délétion d’un motif répété. Un lien significatif entre l’invasivité des infections cutanées et un isolat ayant une protéine GRAB complète a été démontré. Le rôle de la protéine GRAB a été exploré grâce au développement d’un modèle ex vivo d’explant cutané humain, et la construction d’un plasmide thermosensible, pBFK, pour générer un mutant isogénique complètement délété pour grab. Une interaction, GRAB-dépendante, de SGA avec l’A2M (alpha-2-macroglobulin) à un stade tardif de la croissance bactérienne intra-tissulaire a été mise en évidence. Une autre anti-protéase, l’A2ML1 (A2M-like1), interagit avec SGA, indépendamment de GRAB, au début de la croissance. Ainsi, SGA interagit avec deux protéases cutanées humaines, A2M et A2ML1, à deux phases distinctes de sa croissance.
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Biologie
/ 26-09-2017
Bunel Morgane
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Le chien présente de nombreuses maladies génétiques dont les rétinopathies auxquelles je me suis intéressée. Historiquement, l’homme a appliqué aux chiens une sélection artificielle extrêmement forte, créant ainsi près de 400 races répondant à des besoins spécifiques. En uniformisant ainsi de nombreux traits phénotypiques et comportementaux, l’homme a sélectionné les allèles recherchés mais a également concentré involontairement des allèles délétères responsables de maladies génétiques. Ces maladies étant pour beaucoup cliniquement et génétiquement similaires aux maladies humaines, le chien constitue alors un modèle de choix pour en rechercher les bases génétiques et développer de nouvelles thérapies pour un bénéfice mutuel pour l’homme et le chien. J’ai travaillé sur l’Atrophie Progressive de la Rétine (APR) dans deux races avec le concours du Dr Gilles Chaudieu et des clubs de race : le border collie et le berger picard. Concernant l’APR du border collie, les analyses réalisées avant mon arrivée avaient identifié un locus de 20Mb sur le chromosome X. J’ai tout d’abord mis à jour les données épidémiologiques et cliniques d’environ 500 chiens et poursuivi la collecte de prélèvements. Une analyse de liaison génétique pangénomique sur 130 chiens m’a permis de confirmer le mode de transmission et le locus. J’ai ensuite conduis plusieurs analyses génétiques (« homozygosity mapping », analyses des génotypes, séquençage de gènes candidats) sans pour autant réduire le locus ni identifier de mutation causale. Dans ce contexte et grâce à l’avènement des nouvelles technologies de séquençage, j’ai choisi de séquencer le génome complet de trois chiens atteints et deux porteurs apparentés. Ce travail m’a permis d’identifier 117variants dont 9 dans le locus d’intérêt, mais aucun dans des régions codantes. Je me suis donc focalisée sur les variants de régions régulatrices pour 13 gènes candidats. De plus, j’ai identifié cinq variants structuraux, encore en cours d’étude. Concernant l’APR du berger picard, nous avons relancé le projet par la collecte de prélèvements et la réalisation d’un pedigree de 154 chiens. Ce travail a amené à une collaboration tripartite internationale par le séquençage de deux chiens atteints et deux indemnes d’APR, dont les analyses sont en cours. Cette thèse m’a permis d’aborder la génétique d’une maladie génétique rare chez l’homme grâce à un modèle spontané original ; et même si ce travail n’a pas abouti à l’identification de mutations à ce jour, ces APR restent de bons modèles génétique et thérapeutique pour les rétinites pigmentaires humaines.
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Biologie
/ 21-09-2016
Caous Renaud
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Une surprolifération cellulaire associée à de l’aneuploïdie est un marqueur couramment retrouvé dans les cancers et une faible instabilité génétique peut-être un élément aggravant (sinon déclencheur) de la tumorigénèse. Récemment, il a été montré sur un modèle de cellules cancéreuses en culture qu’une forte aneuploïdie compromet la prolifération cellulaire en entraînant la mort de ces dernières. Au cours de ma thèse, nous avons souhaité tester si cette hypothèse se vérifiait in vivo en utilisant comme modèle, les tumeurs du système nerveux central de la larve de D. melanogaster. Nous avons fait le choix d’utiliser des mutants pour des gènes impliqués dans la formation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes (Sas-4 ou AurA) afin d’induire ces tumeurs. Pour générer l’aneuploïdie, nous avons choisi d’associer les mutations sas-4 ou aurA avec des mutations pour des gènes essentiels du SAC, Mad2 ou BubR1ken. Nous avons ensuite analysé par immunofluorescence et microscopie l’effet de la perte du SAC sur la prolifération des Nb. Pour sas-4, la perte du SAC cause l’apparition d’une forte aneuploïdie et une baisse du nombre de Nb associée à une forte réduction de taille des cerveaux. Cela compromet totalement la capacité des cerveaux mutants à induire des tumeurs lorsqu’on les injecte dans l’abdomen de mouches adultes saines. Dans le cas d’aurA, ni hausse de l’aneuploïdie dans le tissu ni baisse de la prolifération des Nbs n’ont été observés. Par ailleurs, la même forte proportion de mouches injectées avec des cerveaux aurA ou aurA mad2 développant une tumeur a été constaté. Afin de mieux comprendre pourquoi le mutant aurA ne réagit pas comme le mutant sas-4 à la déplétion du SAC, nous avons entrepris une analyse détaillée des mutants aurA et aurA mad2. Nous avons d’abord observé que, malgré la perte du SAC, 1) il existe toujours un délai en mitose dans aurA mad2 et 2) il existe un délai entre la satisfaction du SAC et l’entrée en anaphase dans aurA. Comme l’entrée en anaphase est dépendante de la dégradation de la CycB et de la Sécurine via l’APC/C, nous avons analysé le comportement de la CycB (couplé à une étiquette GFP) par vidéo-microscopie en temps réel et observé un défaut de la régulation de la dégradation de cette dernière dans le mutant aurA ainsi que dans le double mutant aurA mad2. Ces observations nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour la kinase AurA dans la régulation de la dégradation de la CycB en fin de mitose.
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Signal, image, vision
/ 14-11-2022
Caranfil Anca-Georgina
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La microscopie de fluorescence permet de s'appuyer sur la modélisation mathématique pour l'étude de mécanismes cellulaires complexes, mais les modèles préexistants ne permettent pas d'obtenir des informations à la fois sur les tendances globales et les comportements locaux, et ne sont pas adaptés à l'étude des interactions complexes entre les différents acteurs moléculaires. Dans cette thèse, nous proposons une approche mixte conçue pour pallier ces limitations, et l'appliquons à l'étude de deux mécanismes cellulaires. Nous proposons un premier modèle pour l'estimation de la diffusion locale en imagerie TIRF ; ce modèle permet l'évaluation de la diffusion en plusieurs spots de diffusion dans une région d'intérêt, répondant ainsi aux problèmes complexes causés par l'hétérogénéité de la membrane. Un deuxième modèle est introduit pour l'étude du comportement des centrosomes durant la division cellulaire, qui permet une meilleure compréhension des facteurs, et des interactions de ces facteurs, qui contribuent aux oscillations des centrosomes durant l'anaphase; ce modèle fournit des moyens de prédiction pour des phénotypes liés à des divisions asymétriques erronées. Ces deux modèles sont utilisés grâce à un nouveau cadre d'estimation de paramètres, qui s'appuie sur l'analyse de sensibilité et les méthodes bayésiennes ABC. Ce framework est polyvalent et facilement adaptable à d'autres contextes que celui des études présentées dans cette thèse.
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Génétique, Génomique, Bioinformatique
/ 05-10-2018
Correard Solenne
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L’identification des mutations génétiques impliquées dans les maladies rares est un prérequis pour mieux les comprendre, les traiter et accompagner les patients. Pour se faire, des modèles animaux présentant des maladies spontanées homologues aux maladies humaines sont très prometteurs. Le chien développe spontanément des maladies génétiques, rares chez l’Homme, mais fréquentes dans certaines races de chiens, ce qui simplifie les analyses génétiques. Ma thèse a porté sur deux maladies neurologiques : l’épilepsie et la neuropathie. Pour l’épilepsie, l’objectif était d’identifier des variants génétiques à partir de données de génotypage et de séquençage de génomes complets de deux races canines prédisposées. Un locus lié à la maladie a été identifié dans une race et des variants ponctuels et structuraux candidats ont été identifiés dans les deux races et sont en cours de validation par séquençage ciblé. Pour la neuropathie, l’équipe avait identifié une mutation en amont du gène GDNF, responsable d’une neuropathie sensitive chez des chiens de chasse. J’ai participé à la validation fonctionnelle de cette mutation. De plus, GDNF étant un excellent gène candidat pour les neuropathies humaines, j’ai séquencé ce gène chez 111 patients et extrait les variants de GDNF d’une base de données d’exomes et de génomes de plus de 600 patients. J’ai ainsi identifié 21 variants rares ou inconnus et les ai priorisé selon leurs impacts prédits in silico. Ces deux projets, alliant analyses génétiques, génomiques et fonctionnelles, chez l’homme et le chien, montrent le potentiel du chien pour l’identification de gènes candidats dans des maladies rares et/ou complexes chez l’Homme.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 20-10-2022
D'Urso Gaetano
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Le présent travail effectué au cours de cette thèse se concentre sur le mécanisme le plus important impliqué dans le contrôle de la qualité de la synthèse des protéines bactériennes, appelé trans-traduction. La trans- traduction est essentielle pour la survie des cellules bactériennes car elle permet le sauvetage des ribosomes bloqués sur l'ARNm non-stop pendant la traduction, permettant leur recyclage avec la dégradation simultanée du messager défectueux et la dégradation de la chaîne polypeptidique naissante non fonctionnelle. Les deux principaux acteurs impliqués dans ce processus sont l'ARN transfert-messager (ARNtm), une molécule d'ARN chimérique capable de jouer à la fois le rôle d'un ARNt et d'un ARNm, et son partenaire la petite protéine basique B (SmpB), qui est essentielle pour la liaison au ribosome, le positionnement correct du codon de reprise et l'expulsion de l'ARNm non-stop du ribosome. Dans a première section de ce manuscrit, nous expliquons l'étude structurale, par cryo-EM, du processus de trans-traduction qui nous a permis de reconstruire quatre structures atomiques à haute résolution du ribosome dans quatre différentes étapes consécutives de ce mécanisme (pré- accommodation, accommodation, translocation et post-translocation). De cette façon, nous avons pu mettre en évidence les interactions moléculaires au niveau atomique qui sont essentielles à l'ensemble du processus et qui sont particulièrement intéressantes car elles peuvent être utilisées comme cibles contre lesquelles de nouvelles molécules à activité antibactérienne peuvent être développées. Dans la deuxième partie du travail, nous avons concentré notre attention sur la caractérisation structurelle d'un troisième composant impliqué dans la trans-traduction, connu sous le nom de RNase R. La RNase R est une ribonucléase essentielle pour la dégradation de l'ARNm non-stop. Il a été observé qu'elle entre en compétition avec l'ARNtm pour le même site de liaison sur le ribosome, et qu'elle est très dynamique lorsqu'elle interagit avec le ribosome lui-même. Pour cette raison, l'étude a été étendue à un système plus complexe dans lequel nous avons cherché à comprendre le rôle exact des trois acteurs (ARNtm, SmpB et RNase R) lors du décrochage de deux ribosomes sur le même ARNm défectueux (disomes). Cette étude est toujours en cours. Dans le dernier chapitre, nous avons décrit une nouvelle conformation particulière pour l'une des protéines les plus importantes du ribosome, connue sous le nom de bS1. Cette protéine est essentielle dans les premières étapes de la traduction. Dans ce cas, l'un de ses six domaines, normalement connu pour être impliqué dans l'interaction avec le ribosome, présente une conformation particulière qui lui permet d'interagir avec la portion Shine-Dalgarno de l'ARNm, stabilisant ainsi sa liaison avec son homologue à l'extrémité 3' de l'ARNr 16S. Cette observation pourrait ouvrir la porte à une meilleure compréhension du mécanisme d'action de cette protéine.
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Biologie moléculaire et structurale, biochimie
/ 14-12-2018
Damodaran Arun Prasath
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Aurora-A est une sérine/thréonine kinase connue pour réguler les événements mitotiques dans les cellules. Sa surexpression dans les tumeurs favorise la survie cellulaire en modulant la prolifération cellulaire et en inhibant l’apoptose. Auparavant, il avait été montré qu'Aurora-A était important pour la stabilité d'une protéine riche en sérine / arginine (SR), ASF/SF2, modifiant ainsi l'épissage alternatif des gènes liés à l'apoptose. En cohérence avec ce rôle dans l'épissage, nous avons découvert que l'interactome d'Aurora-A contient un grand nombre de composants du spliceosome - des protéines spliceosomales centrales et non essentielles. Mon travail de thèse a consisté à caractériser la fonction de Aurora-A dans l'épissage pré-ARNm et à étudier sa fonction au niveau moléculaire. J’ai montré qu'Aurora-A interagissait directement avec des facteurs d'épissage, tels que les protéines SR et les protéines hnRNP, et phosphorylait également quelques-unes d'entre elles in vitro. J’ai démontré qu'Aurora-A est important pour la stabilité de ASF/SF2 et de nombreuses autres protéines SR. En utilisant la microscopie à immunofluorescence, j’ai démontré en outre qu'Aurora-A localise vers les taches nucléaires, les sites où les protéines d'épissage sont stockées, ainsi qu'à la périphérie des taches nucléaires où une majorité d'épissage de pré-ARNm est connue. L'ajout d'Aurora-A recombinant améliore notamment l'efficacité d'épissage du pré-ARNm de la bêta-globine in vitro. En analysant la méthode RNA-seq à l'aide de l'outil VAST, j'ai identifié 414 événements d'épissage alternatifs qui sont modifiés lors de l'inhibition de Aurora-A. De manière surprenante, les protéines kinases SR importantes, CLK1 et CLK4, sont également identifiées comme étant épissées de manière alternative d'une manière dépendante de Aurora-A. Dans l’ensemble, mes travaux révèlent le rôle important et novateur d’Aurora-A dans l’épissage des ARNm et suggèrent des voies moléculaires permettant à Aurora-A de moduler les facteurs d’épissage et d’épissage.
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Biologie
/ 15-12-2017
Daniel Emeline
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Les cellules épithéliales forment un tissu de cellules étroitement juxtaposées qui assure une barrière physique et chimique entre les compartiments internes et externes du corps. L’intégrité de ces tissus est donc essentielle. Au cours du développement et de la vie adulte, le tissu doit grandir ou se régénérer, ce qui implique de nombreuses divisions cellulaires. La dernière étape de la division, la cytodiérèse, met en jeu la formation d’un anneau contractile qui, en se fermant, va séparer les cellules sœurs. Une fois complètement fermé, il donne naissance au midbody, juste sous le niveau des jonctions adhérentes, au sein des jonctions septées, chez la drosophile. L’ultime étape, l’abscission, permet la séparation physique définitive et l’isolation cytoplasmique des cellules sœurs. Si de nombreuses études ont décrit ces processus dans les cellules isolées, peu de choses sont connues quant à la cytodiérèse des cellules épithéliales. Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence que malgré le recrutement de tous les effecteurs et régulateurs de l’abscission, celle-ci est retardée dans les cellules épithéliales. Des expériences de photo-conversion de KAEDE ont montré que l’abscission est liée à l’entrée en mitose des cellules épithéliales. La question de l’intégrité du tissu et notamment de la barrière de perméabilité a ensuite été investigué. Nous avons montré que les cellules voisines formaient des protrusions de membrane restant connectées au midbody tout au long de sa lente migration vers le pôle basal des cellules. Les expériences de FRAP menées sur les jonctions bicellulaires et tri-cellulaires des jonctions septées ont permis de montrer que celles-ci se formaient juste sous les jonctions adhérentes et toujours au-dessus du midbody, participant ainsi à la migration de ce dernier vers le pôle basal. Les contacts maintenus avec les voisines ainsi que l’assemblage polarisé des jonctions septées participent au maintien de l’intégrité du tissu au cours des divisions de cellules épithéliales.
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Biologie cellulaire, biologie du développement
/ 07-01-2020
Daudé Marion
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Au cours de la cytocinèse épithéliale, la nouvelle interface formée entre les cellules filles est le lieu du remodelage des barrières mécanique et de perméabilité, ainsi que l’initiation de la communication cellulaire. Pour comprendre comment ces fonctions sont maintenues tout au long de la division jusqu’à l’abscission, nous utilisons l’épithélium du thorax dorsal de Drosophila au stade pupal. Cet épithélium est composé de cellules épidermiques à division symétrique ; et de précurseurs des organes sensoriels (SOP) à division asymétrique, qui génèrent deux cellules filles (pIIb/pIIa) dont l’identité dépend de l’activation différentielle de la voie de signalisation Notch. Dans ces cellules épithéliales, le midbody se forme suite à la constriction asymétrique de l’anneau de cytocinèse, puis se déplace basalement dans les jonctions septées (SJ) grâce à la maturation apico-basale des nouvelles SJ. Les expériences de photoconversion montrent que l’isolation cytoplasmique se produit 60-70 min après l’anaphase des SOP, un moment qui coïncide avec le recrutement de Shrub/ESCRT-III ; un régulateur connu de l’abscission. La perturbation de Shrub indique que la protéiine contrôle le moment de l’isolation cytoplasmique dans pIIb/pIIa, et affecte l’intégrité des SJ. Aussi, en parallèle, nous étudions si les composants de SJ peuvent réguler l’abscission dans les filles des SOP. Ces travaux devraient donc permettre de mieux comprendre le lien entre le remodelage des SJ, l’abscission et l’acquisition de l’identité cellulaire.
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Biologie
/ 15-01-2015
David Géraldine
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Dans les cellules eucaryotes, l'expression des gènes est régulée à de multiples étapes. Les régulations post-transcriptionnelles regroupent l'ensemble des contrôles qui s'exercent sur un ARN, en particulier sa maturation nucléaire, sa stabilité et son contrôle traductionnel. Les protéines de liaison aux ARN sont des acteurs majeurs de ces régulations post-transcriptionnelles. Les protéines CELF1 et ELAVL1, abondantes et quasiment ubiquitaires, participent à ces différents niveaux de régulation et sont susceptibles de modifier le devenir des transcrits. Au cours de ces travaux, nous avons étudié l'impact de CELF1 sur l'abondance et la maturation des ARN par des approches transcriptomiques. Nous avons classé les transcrits en fonction de leurs réponses aux différentes inactivations. L'ensemble de ces données montre que i) CELF1 et ELAVL1 ont des rôles bivalents, leur déplétion étant associée à une répression ou une activation de certains gènes ; ii) dans des cellules HeLa, les effets des différentes déplétions sont majoritairement des effets indirects ; iii) CELF1 et ELAVL1 ont très majoritairement le même effet sur l'abondance des ARNm qu'elles contrôlent directement ; iv) CELF1 et ELAVL1 ont le plus souvent des effets coopératifs ou redondants sur l'abondance des transcrits liés. L'effet combinatoire de CELF1 et ELAVL1 dépend de l'ARNm considéré, révélant une complexité des régulations post-transcriptionnelles critiques pour le devenir d'une cellule.
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