La prolifération et la différenciation cellulaires sont des processus essentiels qui sous-tendent le développement des organismes multicellulaires. L'arrêt de la prolifération cellulaire précède généralement la différenciation terminale, suggérant que ces deux processus pourraient être coordonnés. Nous avons utilisé le développement très stéréotypé de l'intestin de C. elegans pour déterminer si les contrôles des programmes de prolifération et de différenciation sont systématiquement couplés. Nous montrons qu'un retard dans l'arrêt du cycle cellulaire entraîne un retard dans le recrutement de certains composants seulement de la bordure en brosse. Réciproquement, nous constatons que l'arrêt du cycle cellulaire repose sur les facteurs de différenciation ELT-2 et ELT-7 uniquement dans les cellules intestinales postérieures. L'apparition de divisions surnuméraires en l'absence d'ELT-2 et d'ELT-7 est associée à des changements dans le profil d'expression des régulateurs du cycle cellulaire CKI-1 et cycline B1. Notre travail démontre donc l'existence d'interactions réciproques entre la prolifération et la différenciation cellulaire. Il montre cependant aussi que ces deux processus ne sont que partiellement couplés, suggérant l'existence de mécanismes supplémentaires assurant leur contrôle temporel.

Près de la moitié des mélanomes cutanés diagnostiqués comportent une altération activatrice sur le codon V600 du gène codant pour la protéine kinase BRAF. Cela a permis l'avènement des inhibiteurs ciblant spécifiquement la forme mutée de la protéine, révolutionnant ainsi le traitement de cette maladie. L'efficacité de ces thérapies ciblées demeure néanmoins limitée par l'émergence rapide de mécanismes de résistance. Cette réalité clinique souligne le besoin urgent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour surmonter la résistance et améliorer la survie des patients. Dans cette étude, nous montrons que l'activité mitochondriale, l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et l'augmentation de la peroxydation des lipides conduisent à une plus grande vulnérabilité vis-à-vis de la mort par ferroptose des cellules de mélanome résistantes aux inhibiteurs de BRAF. Ainsi, nous avons pu montrer que la ferroptose constituait une opportunité thérapeutique pour cibler les cellules résistantes, qui présentent une sensibilité accrue aux inducteurs chimiques de cette forme de mort cellulaire. En outre, nos résultats suggèrent fortement que le facteur de transcription Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR), dont nous avons déjà montré l’implication dans l’acquisition de la résistance aux thérapies ciblées, joue également un rôle dans l’émergence de cette vulnérabilité à la ferroptose.

L’un des premiers événements déclenchés par l’induction de dommages à l’ADN est le recrutement de PARP1, ainsi que de son partenaire, HPF1, sur les sites endommagés. Ces deux protéines collaborent pour catalyser l’ajout d'ADP-ribose sur des protéines situées autour des régions endommagées, avec PARP1 et les histones comme principaux accepteurs. Bien que des recherches approfondies aient été menées sur le rôle de l'ADP-ribosylation dépendante de PARP1 en réponse aux dommages dans l’ADN, la contribution exacte de HPF1 dans ce processus demeure incertaine. Tout au long de ma thèse, je me suis focalisée sur les mécanismes régulant la signalisation par l’ADP-ribosylation en réponse aux dommages à l’ADN et plus particulièrement sur les rôles d’HPF1 dans les premières étapes de la réponse aux dommages à l’ADN. À l’aide de techniques d’imagerie photonique sur échantillons vivants, je décris les fonctions de l’ADP-ribosylation des histones contrôlée par HPF1. Cette modification induit non seulement la relaxation de la chromatine à proximité des lésions, mais facilite également le recrutement de protéines de réparation sur les sites endommagés, favorisant ainsi une réponse efficace à la réparation. De plus, mes recherches ont contribué à démontrer que l’ADP-ribosylation à la fois des histones et de PARP1 lui-même joue un rôle central dans la dissociation entre PARP1 et l’ADN endommagé, ce qui se traduit par une résistance aux inhibiteurs de PARP (PARPi). Enfin, la protéine ALC1 émerge également comme un acteur majeur facilitant le relargage de PARP1 via son activité de remodelage, contribuant ainsi à la résistance aux PARPi. Mes travaux soulignent ainsi le rôle essentiel de HPF1 dans la régulation des premiers événements de la réponse aux dommages de l’ADN.

La régulation du volume des cellules est un aspect crucial de la biologie des organismes vivants. Ainsi, la taille des cellules a un impact sur leur biochimie et leur organisation interne, et joue un rôle clé dans leur interaction avec l'environnement. De manière surprenante, alors que divers mécanismes contribuant à la régulation du volume cellulaire à court terme ont été décrits, le rôle de ce paramètre morphologique dans l'adaptation sur le long terme reste inconnu. Pour étudier cette question, nous avons optimisé de nouvelles méthodologies pour la mesure directe du volume cellulaire et l'évolution automatisée de la levure. Nous avons ensuite tiré parti de ces technologies pour réaliser des expériences d'évolution en laboratoire en soumettant des cellules de levure de fission à différentes conditions adverses. La plupart des populations évoluées que nous avons ainsi obtenues présentent des changements remarquables de volume cellulaire, changements qui sont associés à leur adaptation. Le séquençage du génome de l'une de ces populations, qui a évolué en présence de phénylalanine comme unique source suboptimale d'azote, a révélé des altérations génétiques adaptatives dans le facteur de transcription Toe2, le facteur de Nonsense Mediated Decay (NMD) Upf1, ainsi qu’une amplification génétique d’un gène codant pour un transporteur de spermidine, SPBC36.01c, dont l’expression est régulée par Toe2. Nous avons alors montré que la mutation de Toe2 et l'augmentation du nombre de copies de SPBC36.01c ont un effet synergique sur l’adaptation de cette population. Bien qu’un lien de causalité entre altération du volume cellulaire et évolution n'ait pas été observé, notre étude a mis en évidence un nouveau motif d’adaptation qui combine modulation transcriptionnelle et variation ciblée du nombre de copies d’un gène cible. Ce module pourrait être conservé et contribuer à l’évolution des cellules eucaryotes dans des environnements délétères variés.

Le cristallin permet à la lumière de se focaliser sur la rétine. Son opacification due à l'âge, à des facteurs environnementaux ou à certaines variations génétiques provoque une cataracte pouvant conduire à une cécité. Le contrôle post-transcriptionnel exercé par la protéine de liaison à l'ARN CELF1 est critique pendant le développement du cristallin. Au cours de ma thèse, j'ai identifié les cibles ARN de CELF1 dans le cristallin afin de comprendre les régulations post-transcriptionnelles qu'elle exerce et les causes de la cataracte observée en absence de cette protéine. J'ai d'abord mené une analyse transcriptomique par RNA-seq sur des cristallins de souris nouveau-nées pour décrire à l'échelle globale les perturbations transcriptomiques qui se produisent dans le cristallin déficient en CELF1. J'ai ensuite recherché les ARN dont l'épissage alternatif est régulé par CELF1 dans le cristallin. Dans ce but, j'ai intégré différentes approches omiques: profilage d'expression par RNA-seq, et identification des sites de liaison de CELF1 sur ses ARN ligands par iCLIP-seq. J'ai ainsi notamment démontré que CELF1 contrôle l'épissage alternatif de sept ARNm codant des protéines associées au cytosquelette: Ablim1, Ctnna2, Clta, Ywhae, Septin8, Sptbn1 et Ank2. Enfin, j'ai caractérisé un nouveau modèle d'organoïde de cristallin qui peut reproduire certains processus du développement du cristallin. Ce modèle pourrait être un outil précieux pour la communauté de recherche sur le cristallin.

L'ubiquitination est l’un des principaux types de modification post-traductionnelle des protéines. Cette cascade est responsable de l'ajout d'une petite protéine, l'ubiquitine, à la protéine dite substrat et joue un rôle crucial dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires. Des perturbations de ce mécanisme d’ubiquitination sont à l'origine de nombreuses maladies humaines, telles que le cancer ou des troubles neurodégénératifs. La liaison de l'ubiquitine est catalysée par une cascade enzymatique par quatre classes principales d'enzymes, parmi lesquelles les ligases E3 sont le groupe le plus important, ce qui affecte directement la spécificité des processus d'ubiquitination. Il semble donc que ces enzymes jouent un rôle clé dans l'ubiquitination correcte de substrats spécifiques et peuvent être des cibles potentielles dans le traitement de maladies causées par des perturbations dans les cascades d’ubiquitination. Un nombre limité de paires E3/substrat ont été décrites jusqu'à présent, et celles décrites sont principalement connues par une approche biochimique qui ne correspond pas entièrement aux conditions physiologiques de la cellule. L'objectif de cette thèse était d'étudier les interactions et les substrats putatifs de certaines ligases E3 dans les cellules vivantes afin de maintenir les conditions physiologiques du fonctionnement de ces enzymes. Les travaux ont été réalisés en plusieurs étapes, qui ont consisté à : l’optimisation d'un protocole à haut débit pour détecter les interactions/substrats E3 putatifs dégradés dans une cellule vivante, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de paires d'interacteurs de la ligase E3 et des résidus pertinents pour leur liaison, la vérification de l'interaction des enzymes E3-E2, la réalisation d'une étude systématique à haut débit pour identifier de nouveaux substrats putatifs de la ligase E3 destinés à la dégradation via ces voies, la vérification de l'autoubiquitination du domaine RING in vitro. Nous avons utilisé des techniques in vivo modernes basées sur la plus petite et la plus brillante luciférase connue, appelée NanoLuc, y compris le test de complémentation des protéines (PCA) optimisé pour le criblage à haut débit des interactions dans les cellules. Au total, nous avons testé environ 6000 interactions potentielles pour chacune des ligases. Les souches ont toutes été soumises à des mesures de luminescence grâce auxquelles nous avons identifié plusieurs nouvelles interactions non encore décrites dans la littérature. En outre, sur la base de la technique optimisée, nous avons effectué un criblage afin de trouver des changements de protéines à l'échelle du protéome après la mutation de la ligase choisie. Nous n'avons pu détecter que quelques protéines régulées positivement, dont le niveau accru peut suggérer leur dégradation dérégulée après la désactivation de la ligase. Pour résumer, ce travail a identifié les interactions E3/interacteur et E3/E2 et étudié les substrats putativement dégradés dans la levure, et servira de base à d'autres recherches visant à mieux comprendre le fonctionnement du réseau d'ubiquitination dans les cellules.

Le trafic intracellulaire contrôle la polarité cellulaire intestinale, dont la mise en place et le maintien sont essentiels à la fonction de cet organe. De façon surprenante, la déplétion de la sous-unité μ1B de l’adaptateur de clathrine AP-1B (Ap1m2), impliquée dans le tri polarisé, entraîne des défauts de polarité et une hyperplasie des cryptes dans l’intestin de souris, révélant un nouveau rôle du trafic polarisé dans le contrôle de la prolifération intestinale. Nous avons confirmé les défauts de polarité et l’hyper-prolifération dans un modèle murin d’organoïde intestinal muté pour Ap1m2. L’hyper-prolifération observée est dépendante des voies de signalisation EGFR et mTOR. L’analyse phénotypique révèle également des défauts de différenciation du lignage sécrétoire et une expansion de la zone des cellules souches/progénitrices.De plus, nous avons montré que la localisation du déterminant de polarité apicale, CDC42, est altérée dans les organoïdes mutés pour Ap1m2. La déplétion intestinale de CDC42 induisant des phénotypes similaires à ceux que nous observons, nous émettons l’hypothèse qu’AP-1B régule la prolifération à travers le contrôle de la localisation de CDC42. Nous avons donc montré qu’AP-1B joue un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité de la couche épithéliale en contrôlant la polarité cellulaire, mais aussi la prolifération et la différenciation intestinale. Des travaux complémentaires permettront de caractériser les mécanismes par lesquels AP-1B contrôle la localisation de CDC42 et l’activation des voies de signalisation EGFR et mTOR.

L’hétérogénéité tumorale est une conséquence directe de la dynamique évolutive non observable de la croissance des tumeurs. Elle fait partie des challenges actuels en oncologie car elle est à l’origine de la résistance aux thérapies anti-cancer actuelles, soit par l’expansion d’une population clonale présente résistante, soit par une résistance acquise à la suite de l’exposition aux traitements. Pouvoir caractériser ces clones permettrait de mieux comprendre l’évolution des cancers, et ainsi identifier de nouveaux marqueurs pour les futures thérapies ciblées. C’est dans cet esprit que SomaSnake a été développé : permettre des analyses reproductibles et capables d’apporter une aide pour la compréhension des réponses des cancers aux traitements actuels. SomaSnake est un outil bioinformatique qui a pour but d’harmoniser et de faciliter les analyses de données de caractérisation des génomes tumoraux, particulièrement dans le cas où ces analyses sont étagées dans le temps. En effet, cette tâche peut s’avérer complexe lorsqu’il s’agit d’être en mesure de retrouver avec exactitude les mêmes résultats à partir d’une réanalyse à distance des mêmes données brutes, mais également lorsqu’il s’agit d’en intégrer de nouvelles. SomaSnake est un package conda facile d’installation et d’utilisation permettant de réaliser des analyses classiques telles que le traitement des reads, l’appel des variants somatiques et leur annotation, mais aussi des analyses plus complexes visant à reconstruire les populations clonales et sous clonales des tumeurs.

Le travail effectué se concentre sur la caractérisation d’un mécanisme de résistance décrit chez E. faecium. La mutation d'un seul nucléotide sur le gène eat(A) conduit à la substitution d'un acide aminé (T450I) codant pour la forme variante de la protéine Eat(A)v. Cette mutation entraîne une résistance croisée pour différents antibiotiques (Lincosamides, Streptogramines A et Pleuromutilines) qui ciblent tous le centre de transfert peptidique du ribosome. Eat(A) fait partie des protéines ABC-F dont certaines sont des Protéines de Protection du Ribosome, alors que le rôle de la forme sauvage reste inconnu. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’activité biologique des deux formes de la protéine Eat(A). La mutation à l'origine du phénotype de résistance est située 3 résidus en amont de l'un des deux sites d'hydrolyse de l'ATP. Une différence dans l'activité ATPase entre la forme native et la forme variante de la protéine peut être à l'origine du mécanisme de résistance. Pour répondre à ces questions, nous avons mis au point une méthode de purification pour obtenir suffisemment de protéine soluble pour effectuer des essais in vitro. Nous avons étudié l'impact de la mutation T450I sur l'activité ATPase des protéines, révélant l’importance de l’isoleucine dans l’activité biologique. Nous avons également développé un système de traduction in vitro à partir d’extraits S30 d’E. faecium pour étudier l'impact des deux protéines Eat(A) sur la traduction en suivant la synthèse de la GFP, avec ou sans antibiotiques. Enfin, nous avons entrepris la caractérisation des interactions entre les deux formes d'Eat(A) et le ribosome d'E. faecium en utilisant la technologie cryo-EM.

Au sein du fuseau mitotique, les microtubules, fibres très dynamiques à leurs extrémités, polymérisent à partir des centrosomes (sMTs) et émanent aussi des chromosomes (kMTs). Ces kMTs réalisent une connexion mécanique (indirecte le cas échéant) entre les centrosomes et les kinétochores et peuvent subir un déplacement net vers les pôles, appelée poleward flux. Ces flux sont impliqués en particulier dans la mise sous tension des kinétochores et la correction des erreurs d’attachement des chromosomes. Ainsi, les flux contribuent à une séparation fidèle des chromatides sœurs. L'embryon unicellulaire de Caenorhabditis elegans est depuis longtemps un modèle d'étude de la division cellulaire et constitue donc un modèle classique pour caractériser la dynamique des microtubules à l'aide de microscopie avancée. Bien qu’il dispose de protéines homologues à celles des mammifères, aucun poleward flux n’y a été détecté. Cela est à mettre en regard d’une instabilité dynamique particulièrement rapide et d’une métaphase ne durant qu’une à deux minutes. Lors d’expérience de FRAP, nous avons observé que les deux bordures de la zone blanchie (fronts) se déplacent vers l'intérieur de la zone. Du côté des centrosomes, la dynamique des sMTs suffit à expliquer le mouvement du front correspondant, si l’effet de l’imagerie est pris en compte. Du côté des chromosomes, nous suggérons que le mouvement du front proviendrait des kMTs se déplaçant vers les pôles mais sans les atteindre, en coordination avec la croissance des extrémités (+). Les kMTs glisseraient par rapport aux sMTs restant fixes. Ce flux est détecté proche des chromosomes où les kMTs sont majoritaires sur les sMTs. Ainsi, nous proposons que seuls les kMTs présentent un flux. Ce glissement serait généré par des moteurs moléculaires comme la kinésine-12 KLP-18. Ce glissement est plus rapide du côté Postérieur par rapport au côté Antérieur, suggérant des deux demi-fuseaux de dynamiques distinctes, contrastant avec l’idée admise d’un fuseau symétrique dans une division asymétrique.