La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a révolutionné l’identification en bactériologie et mycologie. L’objectif de ce travail est d’optimiser son utilisation pour les bactéries du genre Streptococcus, en particulier par la distinction de l’espèce S. pneumoniae avec les autres espèces du complexe Mitis (S. mitis, S. oralis et S. pseudopneumoniae), l’identification précise des espèces et sous-espèces du complexe Bovis/Equinus et la détection du clone hypervirulent ST-17 chez S. agalactiae. Afin de répondre aux besoins d’identification spécifiques, plusieurs approches ont été expérimentées. En plus de l’utilisation standard de la base Biotyper 6903 MSP, trois axes ont été explorés : l’application d’un score pondéré pour S. pneumoniae, la création de dendrogrammes pour les streptocoques du groupe Bovis/Equinus et l’analyse de pics caractéristiques pour l’ensemble des isolats étudiés. La base Biotyper a permis l’identification correcte de 94,5% des streptocoques du complexe Mitis. Une souche S. mitis a été identifiée par erreur S. pneumoniae. L’étude de pics spécifiques s’est révélée être l’alternative la plus prometteuse pour distinguer les espèces de ce complexe. Des résultats hétérogènes ont été constatés lors de l’identification de 50 streptocoques du groupe Bovis/Equinus. La meilleure option pour discriminer S. gallolyticus subsp. gallolyticus et S. gallolyticus subsp. pasteurianus a été la création de dendrogrammes. L’étude de 50 souches de S. agalactiae dont 27 appartenant au CC-17 a confirmé la capacité de la spectrométrie de masse à individualiser cette lignée particulière.