Bien que plusieurs mécanismes de l'autophagie aient été caractérisés au cours de la dernière décennie, suivre cette voie en temps réel est un véritable défi. Parmi les événements précoces conduisant à l'activation de l'autophagie, la protéase ATG4B amorce le protagoniste clé de l'autophagie, LC3B. En regard du manque de reporters pour suivre cet événement dans les cellules vivantes, nous avons développé un biocapteur basé sur la technologie Förster’s Resonance Energy Transfer (FRET), répondant à l'amorçage de LC3B par ATG4B. Le biocapteur a été généré en encadrant LC3B dans une paire de fluorophores FRET donneur-accepteur résistant au pH que sont Aquamarine et tdLanYFP. La majeure partie de mon travail de thèse fut consacrée à caractériser ce biocapteur en utilisant un microscope développé dans notre équipe appelé fastFLIM (fast Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Nous avons montré ici que le biocapteur a une double application. Premièrement, le phénomène de FRET indique l'amorçage de LC3B par ATG4B et la résolution de l'image FRET permet de caractériser la répartition spatiale de l'activité d'amorçage. Secondairement, la quantification du nombre de foyers Aquamarine-LC3B détermine le degré d'activation de l'autophagie au sein des cellules vivantes. Nous avons ensuite montré grâce à la régulation négative d'ATG4B (par technologie siRNA), qu'il existe de légers pools de LC3B non amorcés, et que l'amorçage du biocapteur est complètement aboli dans les cellules dont la présence d’ATG4B est totalement abrogée (par technologie CRISPR). Enfin, nous avons criblé les inhibiteurs d'ATG4B disponibles dans le commerce et nous avons illustré leur différent mode d'action en mettant en œuvre une méthode d'analyse à résolution spatiale et haute sensibilité, en combinant la technologie de FRET et la quantification des foyers autophagiques. Ainsi, le biocapteur LC3B FRET ouvre la voie à un suivi hautement quantitatif de l'activité ATG4B dans les cellules vivantes et en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle sans précédent. Parallèlement à cette partie de mes études de thèse, j'ai étudié certaines des altérations mitochondriales retrouvées cellules cancéreuses de mélanome sensibles et résistantes à la chimiothérapie. En effet, j’ai analysé la dynamique mitochondriale ainsi que les niveaux de protéines mitochondriales dites OXPHOS dans les cellules de mélanome résistantes ou non en utilisant un test de microscopie de photoconversion et des tests biochimiques. Les découvertes et observations préliminaires résultant de cette étude ont jeté les bases du projet plus vaste de notre équipe consistant à utiliser des biocapteurs multiplex, y compris le biocapteur LC3B, pour suivre l'autophagie/mitophagie et diverses fonctions mitochondriales simultanément dans les cellules cancéreuses du mélanome.