Le VHB constitue un problème de santé publique mondial avec environ 257 millions de personnes infectées chroniquement. Malgré une vaccination efficace, il reste responsable d’une importante morbi-mortalité. Sa spécificité d’hôte rend difficile les études in vivo et son hépatotropisme complique la mise au point de modèle in vitro imitant l’architecture complexe du foie. La difficulté de cultiver des hépatocytes humains primaires (HHP) qui se maintiennent différenciés sur le long terme pose des limites importantes pour l'étude du VHB. Des modèles de culture d’HHP en 3D ont été développés récemment et offrent un microenvironnement plus proche des conditions in vivo. Nous décrivons ici la caractérisation d’un modèle de culture cellulaire en 3D basé sur la formation de sphéroïdes d’HHP permissifs pour l’infection par le VHB. La susceptibilité à l’infection a été suivie grâce aux dosages de l’AgHBe dans les surnageant de culture, reflet de la présence d’ADN super enroulé dans les cellules. Une infection optimale est obtenue après une incubation des HHP en présence d’un inoculum concentré 50 fois, obtenu à partir de surnageants de culture de cellules HepG.2.2.15. Dans ce modèle, les HHP peuvent être maintenus en culture jusqu’à 38 jours après l’infection et des infections avec une faible quantité d’inoculum viral sont possibles bien que la sécrétion d’AgHBe soit faible. La composition du milieu cellulaire a été ajustée afin d’optimiser l’infection. Le Myrcludex B et l’héparine à forte concentration (133µg/mL) bloquent l’infection. Alors que, étonnamment, l’héparine à concentration physiologique (4µg/mL) dans le milieu de culture la favorise. Des infections avec des plasmas de patients infectés par le VHB sont également envisageables. Des études supplémentaires restent nécessaires pour valider ce modèle.