Le botulisme animal, qui touche principalement les volailles, l’avifaune sauvage et les bovins, se manifeste par une paralysie flasque causée par l’action des neurotoxines botuliques. Les toxines les plus fréquemment associées aux épisodes de botulisme animal sont celles de type C, D, C/D et D/C, produites par Clostridium botulinum du groupe III, une bactérie anaérobie stricte sporulante, regroupée avec les espèces Clostridium novyi et Clostridium haemolyticum, sous le terme Clostridium novyi sensu lato. L’épidémiologie du botulisme animal est encore méconnue et les données d’épidémiologie moléculaire relatives aux souches impliquées dans le botulisme animal sont quasi inexistantes. Ceci s’explique principalement par l’absence d’outils de typage pour caractériser les souches du groupe C. novyi sensu lato, liée aux difficultés pour isoler les souches de ce groupe. L’objectif de la thèse est de développer des outils de typage adaptés à ce contexte particulier pour permettre de mener des investigations épidémiologiques lors d’épisodes de botulisme animal et pouvoir à terme tracer les souches. Dans un premier temps, une méthode d’isolement a été développée et validée sur des souches impliquées dans des épisodes de botulisme animal en France. Cette méthode a permis d’isoler 35 souches associées à des épisodes de botulisme aviaire. Puis un outil de typage MLVA (Multi Loci Variable number of tandem repeats analysis) a été évalué sur la collection de souches isolées puis appliqué en conditions réelles dans le cadre d’investigations menées dans deux épisodes de botulisme animal. Une autre piste de typage a ensuite été explorée via l’étude des systèmes CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR associated protein). Les résultats ont révélé une prévalence de ces systèmes chez 95 % des souches de C. novyi sensu lato, avec une grande diversité (6 types de système CRISPR-Cas). Cette grande diversité n’a pas permis de proposer un outil de typage basé sur les CRISPR-Cas. Enfin, après une première étape d’optimisation des différentes étapes en amont du séquençage , les génomes de C. novyi sensu lato ont été comparés afin d’identifier de nouvelles cibles pertinentes. Ces travaux ont permis de développer une approche permettant de séquencer les souches impliquées dans le botulisme aviaire (depuis l’isolement jusqu’au séquençage de l’isolat) et de mettre en place une méthode MLVA qui se révèle particulièrement adaptée au contexte du botulisme aviaire. Ils ont également permis d’identifier de nouvelles cibles très prometteuses qui permettront de proposer d’autres outils de typage dans le futur, applicables au botulisme animal de manière général.

Les virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPV) et de l’influenza A porcin (swIAV) sont deux acteurs majeurs du complexe respiratoire porcin. Si les connaissances sur les mono-infections SDRPV ou swIAV sont nombreuses, les interactions possibles entre ces virus sont encore largement incomprises. De plus, les vaccins vivants atténués (modified live vaccine, MLV) anti-SDRPV sont administrés chez le porcelet lorsqu’une infection à swIAV peut survenir. Les objectifs de ce projet de thèse étaient d’étudier les effets cliniques, virologiques et immunologiques de la co-infection SDRPV/swIAV chez le porc et d’évaluer l’effet d’une infection grippale sur la vaccination MLV. Nous avons montré qu’une infection à swIAV réduit la multiplication du SDRPV au niveau pulmonaire, retarde la virémie MLV sans diminuer l’efficacité vaccinale et accélère la mise en place de la réponse cellulaire vis-à-vis du SDRPV. Par ailleurs, une pré-infection SDRPV entraîne l’atténuation des signes cliniques, des réponses inflammatoires et antivirales liées à l’infection grippale, et augmente les taux d’anticorps anti-swIAV (IgG, IgA, anti-HA et neutralisants) au niveau pulmonaire. Des analyses de corrélation ont montré que l’induction de la voie de l’interféron de type I, laquelle est bloquée par le SDRPV mais stimulée par le swIAV, paraît jouer un rôle clé dans cette interférence virale bidirectionnelle. L’étude des mécanismes sous-jacents a été initiée via des expériences de co-infections dans un système de co-culture de macrophages pulmonaires et de cellules épithéliales de trachée de porc. Les nouvelles connaissances acquises confirment l’importance de déterminer l’étiologie des syndromes respiratoires, pour adapter au mieux les moyens de maîtrise (dont les protocoles de vaccination) en tenant compte de l’ensemble des agents pathogènes impliqués.

Les deux principaux Gammacoronavirus aviaires, sont le virus de la bronchite infectieuse (IBV) du poulet et le coronavirus de la dinde (TCoV), deux virus génétiquement très proches, à l’exception de leur gène S. Malgré leur ressemblance, la diversité génétique au sein des deux virus est très différente. L’IBV présente une grande diversité génétique qui a été supposée comme étant le résultat d’une vaccination intensive des élevages de poulets qui aurait forcé l’évolution de l’IBV. En contraste, très peu de souches de TCoV ont été détectées et aucun vaccin n’est disponible. L’objectif de ce projet de thèse était donc d’analyser au cours de plusieurs passages ces deux virus dans leurs hôtes en analysant les variants génétiques présents au sein des différentes populations virales avec ou sans pression de sélection pour l’IBV et ce par séquençage haut débit. Pour cela, le développement d’un outil permettant la détection de variants génétiques viraux a été réalisé. Par ailleurs, des méthodes ont été développées afin d’enrichir les échantillons en ARN viral dans le but de mieux les séquencer. L’analyse des populations virales au cours des différents passages a permis de constater des changements rapides de séquence consensus. Pour IBV, une évolution différente du virus a été observée en fonction du statut immunitaire des sujets, avec une sélection de sept variants chez les sujets non vaccinés, contre un chez les sujets vaccinés. Pour TCoV, trois séries de dix passages ont été réalisées au cours desquels cinq changements de séquence consensus ont été observés dès le premier passage et se sont maintenus au cours des passages 5 et 10. Ces changements ont été retrouvés dans les différentes répliques expérimentales, indiquant donc que ces sélections ne sont pas aléatoires. En conclusion ces travaux montrent que l’évolution des Gammacoronavirus aviaires est rapide, dès le premier passage, chez leur hôte naturel.

La vaccination est l’une des stratégies préventives les plus puissantes pour contrôler de nombreuses infections causées par des agents pathogènes. La principale voie d’entrée des pathogènes sont les muqueuses or la plupart des vaccins sont pourtant majoritairement inoculés par la voie parentérale et sont en général capables d’induire des réponses immunitaires protectrices, mais pas toujours. Il est important de disposer de nouvelles stratégies alternatives comme par exemple l’utilisation de vaccins mucosaux. Cependant, l’immunogénicité des vaccins mucosaux sous-unitaires (protéique ou ADN plasmidique) reste bien souvent insuffisante chez des animaux de rente ou chez l’homme ; des améliorations sont nécessaires. Afin d’évaluer la faisabilité d’une telle stratégie chez les porcs, nous avons utilisé un vaccin à ADN plasmidique codant la glycoprotéine B (gB) du virus de la pseudorage porcine (PrV) connu comme étant très fortement immunogénique. Ce plasmide a été associé ou non à quatre nanovecteurs décrits pour le transport d’ADN plasmidique in vivo au niveau de sites mucosaux (chitosan, chitosan mannosylé, KLN47 et PLGA-PEI) et a été inoculé par la voie intranasale chez les porcs. De façon inattendue, le vaccin à ADN nu a induit des réponses immunitaires plus fortes que celles obtenues pour les quatre vaccins à ADN formulés. Cependant, quelques indices laissent suggérer que deux des formulations évaluées, le PLGA-PEI et le KLN47, semblent posséder un pouvoir immunisant plus fort. Plusieurs pistes d’amélioration de la composition vaccinale et du protocole d’inoculation sont discutées à la fin du manuscrit.

L’Union Européenne a adopté une politique très restrictive vis-à-vis de la diffusion et de l’utilisation des organismes génétiquement modifiés (OGM), dont l'utilisation dans l'alimentation est mal acceptée par les consommateurs. Bien qu'un seuil maximal existe pour qu'un aliment soit étiqueté « sans OGM », ne sont aisément détectables que les OGM connus. Un OGM est constitué principalement d’un génome hôte et d’une séquence insérée par un procédé non naturel conférent une propriété particulière à l’organisme comme la résistance à certaines maladies. Depuis quelques années, des OGM dont la séquence insérée n’est pas connue ont été produits, non détectables par des approches utilisées jusqu'à présent (de type PCR). D'où la nécessité de créer un outil de détection d'OGM inconnus, objet de cette thèse, s'appuyant sur les avancées récentes en terme de séquençage haut débit. Statistiquement, chaque organisme a une fréquence d’utilisation des nucléotides dans son génome qui lui est propre. Toute introduction de matériel génétique étranger va modifier localement les fréquences d’utilisation des nucléotides dans cette région, entraînant ainsi des fréquences d’utilisation des nucléotides différentes de celles de l’organisme hôte. En se basant sur cette affirmation, un outil de détection d'OGM inconnu a été mis au point à partir de données de séquençages bactériens dès lors que cet OGM résulte de l'insertion d'un gène étranger, de la troncation ou de la fusion d'un gène pouvant appartenir au génome hôte. L’outil a été testé sur 4 génomes bactériens OGM, 7 génomes bactériens sauvages et sur 42 génomes synthétiques. Les résultats démontrent l’efficacité de la méthode développée ne présentant qu'un gène faux positif et en identifiant plus de 99% des gènes d'inserts OGM.

Les lagovirus infectent les léporidés (lapins et lièvres). Les lagovirus pathogènes tels que le Rabbit haemorragic disease virus (RHDV) et l’European Brown Hare Syndrome virus (EBHSV) provoquent des hépatites virales souvent mortelles ayant de graves conséquences économiques et écologiques. Les lagovirus non-pathogènes tels que les European Rabbit Calicivirus 1 et 2 (RCV-E1 et RCV-E2) et les Hare Calicivirus (HaCV) ne provoquent aucune maladie chez les lapins et les lièvres, respectivement. L’émergence d’un nouveau lagovirus pathogène en 2010, nommé RHDV2, capable d’infecter à la fois les lapins et les lièvres, nous a poussé à nous interroger sur l’origine de la pathogénicité chez les lagovirus. L’hypothèse étudiée est l’évolution de souches non-pathogènes vers des souches pathogènes. Pour cela, la diversité génétique des lagovirus non-pathogènes, peu connue chez le lièvre, a été étudiée chez cette espèce. Onze nouvelles séquences de gène codant la protéine de capside et la première séquence du génome complet d’un virus HaCV ont été obtenues. Ces données ont montré la grande diversité génétique des HaCV et leur circulation bien avant la première détection des EBHSV en 1980. Toutefois, aucun lien évolutif n’a été trouvé avec les EBHSV. De nouvelles séquences de génomes complets ou de régions codantes de RCV-E1 et de RHDV2 ont aussi été caractérisées. Les analyses génétiques ont suggéré qu’un évènement de recombinaison entre un virus RCV-E1 et un virus inconnu était à l’origine de l’émergence des RHDV2. Dans la seconde partie de la thèse, nous avons tenté de développer un nouveau système de génétique inverse (GI) pour le RHDV afin d’étudier les bases moléculaires du pouvoir pathogène. Le génotype et le phénotype in vivo d’une souche RHDV de référence ont été caractérisés, puis des essais de régénération de cette souche en GI ont été effectués in vitro et in vivo pour valider le système en cours de développement. Les résultats obtenus ont montré que le système était capable de produire de l’ARN viral et la protéine de capside in vitro. Les essais in vivo visant à régénérer le virus n’ont pas permis l’infection de lapins. Cependant, la majorité des animaux ont séroconverti. Ces résultats n’ont pas permis de conclure que le système de GI était capable de produire des particules virales infectieuses et des points d’amélioration sont proposés.

Face à l’émergence mondiale d’une des maladies les plus coûteuses pour l’industrie porcine, plusieurs vaccins vivants atténués ou modified live vaccine (MLV) en anglais, ont été développés contre le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPV). Depuis quelques années les MLV font face à des préoccupations grandissantes concernant leur innocuité. Mais peu d’informations sont disponibles quant à la sécurité des MLV dirigés contre l’espèce SDRPV-1 (MLV1). Par conséquent, l’objectif de ce travail de thèse était de produire des connaissances scientifiques quant aux éventuels problèmes d’innocuité des MLV1 liés à l’instabilité génétique du virus, et notamment aux phénomènes de recombinaisons et de mutations, ainsi qu’à l’impact d’une co-infection virale. Par le biais d’approches expérimentales in vivo, ce projet de thèse a permis de mettre en évidence que les événements de recombinaisons et de mutations survenant au cours de la réplication virale des MLV1 et acquis au cours de passages in vivo successifs peuvent conduire à la genèse de souches présentant une augmentation des capacités réplicative et de transmission, ainsi qu’une perte d’atténuation chez le porc. De même, une co-infection virale peut potentialiser la transmission et la virulence d’une souche MLV1 préalablement adaptée sur porc. L’évaluation des risques associés à l’utilisation des MLV1 se révèle fondamentale pour une mise en oeuvre raisonnée de ces vaccins en tenant compte de la balance bénéfice/risque.

Le virus de l’hépatite E (HEV) est un agent zoonotique dont les porcs représentent le principal réservoir dans les pays industrialisés. Le présent projet de recherche a combiné études épidémiologiques, modélisation mathématique et sciences sociales pour proposer des leviers de réduction du risque d’exposition humaine au HEV par consommation de produits à base de porc. Deux essais expérimentaux et une étude en conditions naturelles ont mis en évidence le rôle majeur des co-infections immunomodulatrices dans la dynamique de l’infection par le HEV chez le porc, ces pathogènes intercurrents conduisant à une infection chronique par le HEV et à un risque augmenté de présence du virus dans le foie, le sang et les muscles des animaux abattus. Le développement d’un modèle intra-élevage, stochastique, individu-centré et multi-pathogènes, a permis de dégager des pistes de maîtrise à la fois zootechniques et sanitaires pour réduire la prévalence du virus en élevage. En complément, la conception d’un modèle inter-troupeaux a rendu possible l’analyse des facteurs de diffusion du virus dans un réseau d’élevages français. L’ensemble de ces mesures de gestion du HEV a été soumis à l’avis des organisations publiques et privées et des acteurs individuels de la filière porcine (éleveurs, conseillers, vétérinaires) par des approches de sciences humaines et sociales. Finalement, ce projet transversal et multi-disciplinaire a permis de définir des axes d’action tangibles et réalisables de gestion du HEV dans la filière porcine tout en apportant des contributions méthodologiques significatives en épidémiologie et en modélisation.

Les métapneumovirus aviaires (AMPV) sont responsables d’infections aiguës des voies respiratoires et du tractus génital chez les volailles d’élevage – dont notamment les dindes, poulets et canards – ayant d’importantes conséquences pour l’industrie avicole. A ce jour, quatre sous-groupes (A, B, C et D) et deux lignées d’AMPV-C (Us et Fr) ont été établis selon leurs différences génétiques et antigéniques. Cependant leurs spectres d’hôtes n’ont encore jamais été clairement élucidés. Pour résoudre ce problème, la première partie de cette thèse a consisté à étudier le spectre d’hôte, la pathogénicité comparée et la transmission horizontale des AMPV chez les dindes, poulets et canards. Les résultats de cette étude révèlent que les AMPV-A, B, Us-C et D sont mieux adaptés aux galliformes (dindes et poulets) et que le Fr-AMPV-C est mieux adapté aux palmipèdes (canards). Fait intéressant, des AMPV-C des deux lignées ont été réisolés chez des hôtes pouvant être décrits comme « non conventionnels », à savoir Fr-AMPV-C chez des galliformes et Us-AMPV-C chez des poulets, avec des éléments suggérant que l’expression ou l’intégrité du gène SH ont été modifiés. Pour tester le rôle de SH dans le spectre d’hôte, la seconde partie de ma thèse a consisté à développer un système de génétique inverse pour le Fr-AMPV-C permettant la régénération de virus chimérique dont la protéine SH a été échangé avec celle d’un Us-AMPV-C. Ces virus recombinants ont été testés chez des dindes et canards EOPS en conditions expérimentales. Le virus chimérique n’a pas montré de modification de son phénotype en comparaison avec le virus parental, ce qui suggère que les différences de tropisme d’hôte des différentes lignées d’AMPV-C ne sont pas liées au type de protéine SH. Cependant, cela doit être confirmé en régénérant un virus Us-AMPV-C chimérique qui exprime la protéine SH de Fr-AMPV-C et en effectuant les mêmes essais expérimentaux sur des dindes et canards EOPS.

Les pathologies respiratoires figurent parmi les principales maladies porcines. Le « Complexe Respiratoire Porcin » (CRP) a une étiologie complexe et multifactorielle, qui se traduit par une variété d’expressions cliniques et d’évolutions. Mycoplasma (M.) hyopneumoniae est l’agent étiologique de la pneumonie enzootique porcine et l’agent initiateur du CRP. L’interaction de M. hyopneumoniae avec certains agents infectieux impliqués dans le CRP entraine l’aggravation de la pneumonie. L’identification des interactions les plus défavorables à l’évolution de la maladie représente un défi majeur. M. hyopneumoniae, M. hyorhinis et/ou M. flocculare peuvent co-exister dans la pneumonie, mais l’impact de ces associations n’est pas connu. Nous avons montré, grâce à une enquête exploratoire, que les co-infections entre M. hyopneumoniae et M. hyorhinis et/ou M. flocculare étaient significativement plus présentes dans la pneumonie sévère. Nous avons ensuite comparé la production de cytokines par des cellules dendritiques porcines stimulées par des souches contemporaines de M. hyopneumoniae, M. hyorhinis et M. flocculare, seules ou en association, et nous avons observé que les co-infections mycoplasmiques pouvaient être responsables de modulations de la réponse immunitaire. L’étude expérimentale de ces co-infections sur des porcs exempts d’organismes pathogènes spécifiés a montré notamment un ralentissement de la croissance des animaux par rapport aux animaux infectés uniquement par M. hyopneumoniae. Les analyses génomiques réalisées sur 25 isolats mycoplasmiques appartenant aux trois espèces ciblées ont révélé des diversités génomiques pouvant être impliquées dans la virulence. Ce projet a permis une avancée des connaissances liées aux interactions entre agents infectieux dans la pneumonie et représente une base pour l’élaboration d’études plus approfondies. Enfin, deux outils développés dans le cadre de ce travail, la qPCR multiplex Taqman® pour le dépistage simultané des trois espèces mycoplasmiques et le typage MLST de M. flocculare, pourront justement être utilisés pour mener des études épidémiologiques approfondies et à plus grande échelle, afin de mieux comprendre le rôle de ces associations mycoplasmiques en élevage.