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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 17-12-2021
Bougon Juliette
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Les virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPV) et de l’influenza A porcin (swIAV) sont deux acteurs majeurs du complexe respiratoire porcin. Si les connaissances sur les mono-infections SDRPV ou swIAV sont nombreuses, les interactions possibles entre ces virus sont encore largement incomprises. De plus, les vaccins vivants atténués (modified live vaccine, MLV) anti-SDRPV sont administrés chez le porcelet lorsqu’une infection à swIAV peut survenir. Les objectifs de ce projet de thèse étaient d’étudier les effets cliniques, virologiques et immunologiques de la co-infection SDRPV/swIAV chez le porc et d’évaluer l’effet d’une infection grippale sur la vaccination MLV. Nous avons montré qu’une infection à swIAV réduit la multiplication du SDRPV au niveau pulmonaire, retarde la virémie MLV sans diminuer l’efficacité vaccinale et accélère la mise en place de la réponse cellulaire vis-à-vis du SDRPV. Par ailleurs, une pré-infection SDRPV entraîne l’atténuation des signes cliniques, des réponses inflammatoires et antivirales liées à l’infection grippale, et augmente les taux d’anticorps anti-swIAV (IgG, IgA, anti-HA et neutralisants) au niveau pulmonaire. Des analyses de corrélation ont montré que l’induction de la voie de l’interféron de type I, laquelle est bloquée par le SDRPV mais stimulée par le swIAV, paraît jouer un rôle clé dans cette interférence virale bidirectionnelle. L’étude des mécanismes sous-jacents a été initiée via des expériences de co-infections dans un système de co-culture de macrophages pulmonaires et de cellules épithéliales de trachée de porc. Les nouvelles connaissances acquises confirment l’importance de déterminer l’étiologie des syndromes respiratoires, pour adapter au mieux les moyens de maîtrise (dont les protocoles de vaccination) en tenant compte de l’ensemble des agents pathogènes impliqués.
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Microbiologie, Parasitologie, Virologie
/ 27-04-2018
Cevallos Almeida María Belén
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Salmonella est la deuxième cause de zoonoses humaines dans l’Union Européenne et représente un enjeu majeur pour la filière porcine. Les sérovars, S. Typhimurium, S. Derby et le variant monophasique de S. Typhimurium sont très prévalents chez le porc et également chez les humains. Les objectifs de ces travaux étaient d’établir la dynamique d’infection chez le porc par Salmonella en condition d’élevage conventionnel et expérimental, d’évaluer le pouvoir colonisateur chez le porc et le pouvoir pathogène chez les humains des trois sérovars. En élevage conventionnel, le suivi sérologique des anticorps anti-Salmonella a permis d’évaluer l’âge moyen de séroconversion à 137 jours et d’identifier un « effet ferme » sur l’âge de séroconversion. Le premier essai en condition expérimentale a mis en évidence que les porcs inoculés avec le variant monophasique de S. Typhimurium excrétaient ce sérovar de façon continue dans les fèces. Aux dates d’autopsies 21, 49 ou 84 jours après inoculation, les salmonelles ont été retrouvées dans les différentes parties de l’intestin, dans les nœuds lymphatiques et à des niveaux très élevés dans les amygdales. Après passage dans le tractus digestif, des profils MLVA différents de celui de la souche inoculée ont été identifiés suggérant que le génome de la souche a évolué. Le deuxième essai visant à comparer le pouvoir colonisateur chez le porc des trois sérovars a montré que la dynamique d’excrétion et de colonisation était similaire quel que soit le sérovar. Cependant, la quantité excrétée était significativement différente ; plus élevée avec le variant monophasique par rapport à S.Typhimurium. Le pouvoir pathogène chez l’homme de 15 souches d’origine porcine appartenant aux 3 sérovars a été évalué in vivo sur un modèle insecte Galleria mellonella, et in vitro sur cellules Caco-2. Les souches se sont révélées être potentiellement virulentes. Sur Caco-2, le variant monophasique avait un pourcentage d’adhésion aux cellules le plus élevé et Derby le plus bas. Différents niveaux de virulence ont été observés entre souches d’un même sérovar. Ce travail a apporté des nouvelles connaissances sur la problématique Salmonella en filière porcine.
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Microbiologie, Parasitologie, Virologie
/ 30-05-2018
Cisneros Tamayo Marco Vinicio
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M. synoviae (MS) est l'agent causatif du syndrome des œufs à extrémités de verre (traduction anglais de Eggshell apex abnormality syndrome : EAA), maladie caractérisée par une coquille altérée, une translucidité accrue, un amincissement de la coquille, des fissures et des ruptures de l'apex. Trois études de terrain indépendantes ont été menées entre 2015 et 2018 dans des élevages de poules pondeuses en France. La première étude, une enquête épidémiologique, visait à identifier le syndrome EAA par rapport aux symptômes rapportés par les éleveurs. Le but de la seconde étude était d'isoler et d'identifier l'agent étiologique du syndrome EAA. La troisième étude visait à suivre un lot sur une ferme multi-âge avec des problèmes récurrents de EAA dans un lot de poules pondeuses vaccinées et d'identifier les variables qui pourraient expliquer l’expression d’EAA. L'enquête épidémiologique a ciblées 77 exploitations dans trois régions productrices d'œufs, avec 40 lots dans des systèmes alternatifs (ALT) et 56 dans des cages aménagées (FC). Sept lots ont présenté des symptômes spécifiques d' EAA (4 FC et 3 ALT), une prévalence de 7,3% (intervalle de confiance: 0,032-0,149) a été calculée dans cet échantillon. L'enquête a révélé que les symptômes de l'EAA pouvaient être observés à tous les stades de la production. Un faible niveau d'utilisation d'analyse de laboratoire et de vaccination a été identifié. Les résultats ont également suggéré que la vaccination contre MS en tant qu'outil de contrôle avait un effet protecteur contre les symptômes de l'EAA. La deuxième étude de terrain a été menée pour identifier MS par culture et PCR dans 33 lots avec des symptômes d'EAA. MS a été détecté dans 30 des 33 lots des deux systèmes de production (7/7 ALT et 23/26 FC). La détection était significativement plus élevée à partir d’écouvillons trachéaux (59%) qu'avec des écouvillons cloacaux (10,5%), dans l'albumine (3,6%) ou bien dans le jaune d'œuf (0,9%). L'utilisation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF et du séquençage de nouvelle génération a détecté la présence de Mycoplasma pullorum (MP) dans 18 des 30 cas (60%). Quatorze génomes séquencés de MP, assemblés et annotés, sont disponibles dans Genbank. Le génome entier de 44 souches de MS, 31 souches de MP, d'origines différentes, isolées entre 1991 et 2017 ont été séquencées. Les séquences des 44 souches de MS ont été caractérisées en utilisant trois méthodes de typage différentes : typage de la région conservée du gène vlhA de MS, et MLST en utilisant deux schémas différents récemment publiés pour MS. Une partie des séquences des 44 souches de MS ont été attribuées aux allèles et types des séquences déjà décrites, tandis que de nouveaux allèles et types de séquences ont également été mis en évidence. Des arbres phylogénétiques ont été générés en fonction de chaque méthode de typage et par la concaténation des données issues des trois méthodes, permettant ainsi l’identification de différents groupes. L'étude longitudinale a montré un lien possible entre la détection de mycoplasmes et les problèmes de production d'œufs sans mettre en évidence une implication de l’EAA. MS et d'autres mycoplasmes aviaires ont été isolés durant toute l'étude malgré les traitements antimicrobiens et la vaccination. Les résultats de ces études ont confirmé la présence de l' EAA causée par MS en France et permettent de comprendre la situation actuelle de cette maladie sur le terrain. La spectrométrie de masse MALDI-TOF a été identifiée comme une technique de diagnostic rapide, précise et économique. De nombreuses souches de MS ont été isolées, séquencées et typées. La combinaison des méthodes de typage décrites dans ce travail pourrait être un outil précieux et fiable pour le typage des séquences de MS, permettant une meilleure compréhension de l'épidémiologie de l'infection. En ce qui concerne MP, des études devraient être menées pour évaluer son potentiel rôle dans l'expression de l’EAA.
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Biologie
/ 12-12-2016
Deblanc Céline
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La grippe porcine est une infection enzootique touchant 50% du cheptel français. Elle passe parfois inaperçue, mais peut également induire une forte morbidité au sein des lots d’animaux touchés, entraînant une baisse des performances zootechniques et des pertes économiques importantes. La sévérité de l’infection à virus influenza A chez le porc peut dépendre de divers facteurs, comme les virus eux-mêmes, les pratiques d’élevage, le statut immunitaire des animaux, les infections concomitantes par d’autres pathogènes respiratoires, etc. De la même manière, diverses formes épidémiologiques de la grippe existent en élevage. Ainsi, des infections peuvent se répéter à un âge déterminé, sur toutes les bandes successives d’un élevage, notamment chez des jeunes présentant une immunité passive. Afin de mieux comprendre cette diversité clinique et épidémiologique de la grippe porcine, et aider à l’élaboration de stratégies d’intervention adéquates pour le contrôle de la maladie, nous avons cherché à apporter de nouvelles connaissances quant à certains facteurs pouvant favoriser l’exacerbation du syndrome grippal et/ou son caractère récurrent, et plus généralement aux mécanismes sous-jacents à la pathogenèse des virus influenza A chez le porc, en relation avec les réponses de l’hôte infecté. Nous avons d’abord comparé, suite à inoculations expérimentales de porcs exempts d’organismes pathogènes spécifiés, la pathogénicité des deux virus influenza porcins les plus fréquemment rencontrés chez le porc en France, l’un du lignage européen « avian-like swine H1N1 » (H1avN1), l’autre du lignage européen « human-like reassortant swine H1N2 » (H1huN2), seuls ou en association avec Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp), autre pathogène respiratoire répandu en élevage. Nous avons montré que l’infection H1huN2 induit une pathologie plus marquée que l’infection H1avN1, et que la pré-infection des porcs par Mhp induit une exacerbation de l’infection H1avN1, mais pas H1huN2. Nous avons utilisé le modèle de co-infection Mhp/H1avN1 pour évaluer deux approches alternatives qui permettraient de diminuer l’impact des infections grippales et de leurs complications : l’apport de composés aux propriétés antioxydantes via l’alimentation ; et la restriction alimentaire de courte durée. Dans ces deux cas nous avons montré des effets bénéfiques sur les paramètres zootechniques pendant les jours suivant l’infection grippale. Ce travail a également apporté de nouvelles connaissances quant aux modifications des marqueurs plasmatiques de stress oxydant, ainsi que sur les modifications métaboliques faisant suite à la co-infection Mhp/H1avN1. La sévérité des manifestations cliniques de la grippe étant liée à la qualité de la réponse immunitaire mise en place chez l’hôte infecté, nous avons entrepris d‘étudier les réponses immunitaires du porc touché par la grippe et d’évaluer l’impact de facteurs tels que la présence de Mhp ou d’anticorps d’origine maternelle sur ces réponses. Nous avons ainsi montré que l’infection virale induit une inflammation et une réponse interféron. La pré-infection par Mhp exercerait un effet additif sur cette inflammation et pourrait favoriser la persistance du virus dans le poumon. Nous avons également montré que la présence d’immunité passive protège cliniquement le porcelet mais n’empêche pas l’excrétion du virus, retarde la réponse lymphocytaire T et inhibe la réponse humorale post-infectieuse. Malgré la réponse immunitaire humorale défaillante, les animaux étaient totalement protégés d’une seconde infection homologue lorsque les anticorps maternels avaient disparus. Ces travaux ont permis d’apporter de nouvelles connaissances sur les facteurs influençant l’infection grippale en élevage porcin ainsi que sur les mécanismes sous-jacents, ce qui est une prérequis pour l’amélioration des mesures de lutte et de maitrise de la maladie. Ils permettent, d’envisager d’améliorer la santé des animaux en agissant sur leur régime alimentaire.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 08-09-2020
Droillard Clément
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Les lagovirus infectent les léporidés (lapins et lièvres). Les lagovirus pathogènes tels que le Rabbit haemorragic disease virus (RHDV) et l’European Brown Hare Syndrome virus (EBHSV) provoquent des hépatites virales souvent mortelles ayant de graves conséquences économiques et écologiques. Les lagovirus non-pathogènes tels que les European Rabbit Calicivirus 1 et 2 (RCV-E1 et RCV-E2) et les Hare Calicivirus (HaCV) ne provoquent aucune maladie chez les lapins et les lièvres, respectivement. L’émergence d’un nouveau lagovirus pathogène en 2010, nommé RHDV2, capable d’infecter à la fois les lapins et les lièvres, nous a poussé à nous interroger sur l’origine de la pathogénicité chez les lagovirus. L’hypothèse étudiée est l’évolution de souches non-pathogènes vers des souches pathogènes. Pour cela, la diversité génétique des lagovirus non-pathogènes, peu connue chez le lièvre, a été étudiée chez cette espèce. Onze nouvelles séquences de gène codant la protéine de capside et la première séquence du génome complet d’un virus HaCV ont été obtenues. Ces données ont montré la grande diversité génétique des HaCV et leur circulation bien avant la première détection des EBHSV en 1980. Toutefois, aucun lien évolutif n’a été trouvé avec les EBHSV. De nouvelles séquences de génomes complets ou de régions codantes de RCV-E1 et de RHDV2 ont aussi été caractérisées. Les analyses génétiques ont suggéré qu’un évènement de recombinaison entre un virus RCV-E1 et un virus inconnu était à l’origine de l’émergence des RHDV2. Dans la seconde partie de la thèse, nous avons tenté de développer un nouveau système de génétique inverse (GI) pour le RHDV afin d’étudier les bases moléculaires du pouvoir pathogène. Le génotype et le phénotype in vivo d’une souche RHDV de référence ont été caractérisés, puis des essais de régénération de cette souche en GI ont été effectués in vitro et in vivo pour valider le système en cours de développement. Les résultats obtenus ont montré que le système était capable de produire de l’ARN viral et la protéine de capside in vitro. Les essais in vivo visant à régénérer le virus n’ont pas permis l’infection de lapins. Cependant, la majorité des animaux ont séroconverti. Ces résultats n’ont pas permis de conclure que le système de GI était capable de produire des particules virales infectieuses et des points d’amélioration sont proposés.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 07-02-2020
Eclercy Julie
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Face à l’émergence mondiale d’une des maladies les plus coûteuses pour l’industrie porcine, plusieurs vaccins vivants atténués ou modified live vaccine (MLV) en anglais, ont été développés contre le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPV). Depuis quelques années les MLV font face à des préoccupations grandissantes concernant leur innocuité. Mais peu d’informations sont disponibles quant à la sécurité des MLV dirigés contre l’espèce SDRPV-1 (MLV1). Par conséquent, l’objectif de ce travail de thèse était de produire des connaissances scientifiques quant aux éventuels problèmes d’innocuité des MLV1 liés à l’instabilité génétique du virus, et notamment aux phénomènes de recombinaisons et de mutations, ainsi qu’à l’impact d’une co-infection virale. Par le biais d’approches expérimentales in vivo, ce projet de thèse a permis de mettre en évidence que les événements de recombinaisons et de mutations survenant au
cours de la réplication virale des MLV1 et acquis au cours de passages in vivo successifs peuvent conduire à la genèse de souches présentant une augmentation des capacités réplicative et de transmission, ainsi qu’une perte d’atténuation chez le porc. De même, une co-infection virale peut potentialiser la transmission et la virulence d’une souche MLV1 préalablement adaptée sur porc. L’évaluation des risques associés à l’utilisation des MLV1 se révèle fondamentale pour une mise en oeuvre raisonnée de ces vaccins en tenant compte de la balance bénéfice/risque.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 17-12-2020
Flageul Alexandre
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Les deux principaux Gammacoronavirus aviaires, sont le virus de la bronchite infectieuse (IBV) du poulet et le coronavirus de la dinde (TCoV), deux virus génétiquement très proches, à l’exception de leur gène S. Malgré leur ressemblance, la diversité génétique au sein des deux virus est très différente. L’IBV présente une grande diversité génétique qui a été supposée comme étant le résultat d’une vaccination intensive des élevages de poulets qui aurait forcé l’évolution de l’IBV. En contraste, très peu de souches de TCoV ont été détectées et aucun vaccin n’est disponible. L’objectif de ce projet de thèse était donc d’analyser au cours de plusieurs passages ces deux virus dans leurs hôtes en analysant les variants génétiques présents au sein des différentes populations virales avec ou sans pression de sélection pour l’IBV et ce par séquençage haut débit. Pour cela, le développement d’un outil permettant la détection de variants génétiques viraux a été réalisé. Par ailleurs, des méthodes ont été développées afin d’enrichir les échantillons en ARN viral dans le but de mieux les séquencer. L’analyse des populations virales au cours des différents passages a permis de constater des changements rapides de séquence consensus. Pour IBV, une évolution différente du virus a été observée en fonction du statut immunitaire des sujets, avec une sélection de sept variants chez les sujets non vaccinés, contre un chez les sujets vaccinés. Pour TCoV, trois séries de dix passages ont été réalisées au cours desquels cinq changements de séquence consensus ont été observés dès le premier passage et se sont maintenus au cours des passages 5 et 10. Ces changements ont été retrouvés dans les différentes répliques expérimentales, indiquant donc que ces sélections ne sont pas aléatoires. En conclusion ces travaux montrent que l’évolution des Gammacoronavirus aviaires est rapide, dès le premier passage, chez leur hôte naturel.
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Microbiologie, virologie, parasitologie
/ 03-12-2018
Fourour Sarah
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Les pathologies respiratoires figurent parmi les principales maladies porcines. Le « Complexe Respiratoire Porcin » (CRP) a une étiologie complexe et multifactorielle, qui se traduit par une variété d’expressions cliniques et d’évolutions. Mycoplasma (M.) hyopneumoniae est l’agent étiologique de la pneumonie enzootique porcine et l’agent initiateur du CRP. L’interaction de M. hyopneumoniae avec certains agents infectieux impliqués dans le CRP entraine l’aggravation de la pneumonie. L’identification des interactions les plus défavorables à l’évolution de la maladie représente un défi majeur. M. hyopneumoniae, M. hyorhinis et/ou M. flocculare peuvent co-exister dans la pneumonie, mais l’impact de ces associations n’est pas connu. Nous avons montré, grâce à une enquête exploratoire, que les co-infections entre M. hyopneumoniae et M. hyorhinis et/ou M. flocculare étaient significativement plus présentes dans la pneumonie sévère. Nous avons ensuite comparé la production de cytokines par des cellules dendritiques porcines stimulées par des souches contemporaines de M. hyopneumoniae, M. hyorhinis et M. flocculare, seules ou en association, et nous avons observé que les co-infections mycoplasmiques pouvaient être responsables de modulations de la réponse immunitaire. L’étude expérimentale de ces co-infections sur des porcs exempts d’organismes pathogènes spécifiés a montré notamment un ralentissement de la croissance des animaux par rapport aux animaux infectés uniquement par M. hyopneumoniae. Les analyses génomiques réalisées sur 25 isolats mycoplasmiques appartenant aux trois espèces ciblées ont révélé des diversités génomiques pouvant être impliquées dans la virulence. Ce projet a permis une avancée des connaissances liées aux interactions entre agents infectieux dans la pneumonie et représente une base pour l’élaboration d’études plus approfondies. Enfin, deux outils développés dans le cadre de ce travail, la qPCR multiplex Taqman® pour le dépistage simultané des trois espèces mycoplasmiques et le typage MLST de M. flocculare, pourront justement être utilisés pour mener des études épidémiologiques approfondies et à plus grande échelle, afin de mieux comprendre le rôle de ces associations mycoplasmiques en élevage.
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Génétique, génomique, bioinformatique
/ 13-11-2020
Hurel Julie
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L’Union Européenne a adopté une politique très restrictive vis-à-vis de la diffusion et de l’utilisation des organismes génétiquement modifiés (OGM), dont l'utilisation dans l'alimentation est mal acceptée par les consommateurs. Bien qu'un seuil maximal existe pour qu'un aliment soit étiqueté « sans OGM », ne sont aisément détectables que les OGM connus. Un OGM est constitué principalement d’un génome hôte et d’une séquence insérée par un procédé non naturel conférent une propriété particulière à l’organisme comme la résistance à certaines maladies. Depuis quelques années, des OGM dont la séquence insérée n’est pas connue ont été produits, non détectables par des approches utilisées jusqu'à présent (de type PCR). D'où la nécessité de créer un outil de détection d'OGM inconnus, objet de cette thèse, s'appuyant sur les avancées récentes en terme de séquençage haut débit. Statistiquement, chaque organisme a une fréquence d’utilisation des nucléotides dans son génome qui lui est propre. Toute introduction de matériel génétique étranger va modifier localement les fréquences d’utilisation des nucléotides dans cette région, entraînant ainsi des fréquences d’utilisation des nucléotides différentes de celles de l’organisme hôte. En se basant sur cette affirmation, un outil de détection d'OGM inconnu a été mis au point à partir de données de séquençages bactériens dès lors que cet OGM résulte de l'insertion d'un gène étranger, de la troncation ou de la fusion d'un gène pouvant appartenir au génome hôte. L’outil a été testé sur 4 génomes bactériens OGM, 7 génomes bactériens sauvages et sur 42 génomes synthétiques. Les résultats démontrent l’efficacité de la méthode développée ne présentant qu'un gène faux positif et en identifiant plus de 99% des gènes d'inserts OGM.
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Biologie
/ 05-12-2016
Kouokam Fotso Guy-Baudry
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Le circovirus porcin de type 2 est responsable de la maladie d’amaigrissement du porcelet. Il est différent du circovirus porcin de type 1 qui est non pathogène. Nous disposons de peu de données pouvant expliquer pourquoi le virus PCV2 est pathogène et le virus PCV1 ne l’est pas. De plus les bases moléculaires soutenant la pathogénicité du PCV2 et l’immunodépression induite par le PCV2 sont mal comprises. Dans cette étude nous avons montré que la protéine gC1qR était capable d’interagir de façon différentielle avec les protéines de capside (Cap) de circovirus pathogène PCV2 et non pathogène PCV1. La protéine de capside de PCV1 isolée d’un porcelet issu d’un élevage était incapable d’interagir avec la protéine gC1qR. Il a été également montré que la région de la protéine Cap PCV2 impliquée dans l’interaction avec gC1qR était comprise dans les 59 acides aminés N-terminaux, région riche en arginine. Il a été également mis en évidence que les transcrits de gC1qR étaient sous-régulés in vitro et in vivo après une infection par le virus PCV2 au temps court de l’infection. Une sous-régulation de gC1qR induite par ARN interférence en cellules permissives rénales de porc PK15 n’induisait cependant ni une diminution de la réplication du virus PCV2, ni une diminution de formation de ses particules infectieuses. Ce travail apporte de nouveaux éléments pour comprendre l’adaptation des souches de circovirus porcins à leur hôte ainsi que son interaction avec les protéines de son hôte.
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