| Détection moléculaire d'Aspergillus fumigatus : apport diagnostique et surveillance de la résistance aux triazolés. (Molecular detection of Aspergillus fumigatus : diagnostic value and surveillance of triazole resistance.) Guegan, Hélène - (2016-10-27) / Universite de Rennes 1 - Détection moléculaire d'Aspergillus fumigatus : apport diagnostique et surveillance de la résistance aux triazolés.
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Langue : Français Directeur(s) de thèse: Gangneux, Jean-Pierre Discipline : Pharmacie Classification : Médecine et santé Mots-clés : Aspergillus fumigatus , diagnostic , PCR , résistance aux triazolés , gène cyp51A
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Résumé : Aspergillus fumigatus est responsable d’un large spectre de pathologies pulmonaires, notamment chroniques et allergiques, comme l’aspergillose broncho-pulmonaire allergique (ABPA) touchant en particulier les patients colonisés de façon chronique, comme dans la mucoviscidose. Chez l’hôte immunodéprimé, A. fumigatus est incriminé dans des formes invasives ou aspergillose invasive (AI), dont le diagnostic repose sur des arguments cliniques, radiologiques, et microbiologiques, basés principalement sur la culture de prélèvements respiratoires. Les antifongiques triazolés sont utilisés à la fois en première ligne de traitement de l’AI (voriconazole), ou en prophylaxie (posaconazole). Cependant, au début des années 2000, l’émergence de souches cliniques d’A. fumigatus résistantes aux azolés, a été décrite en Europe et donne toute son importance au dépistage in vitro en routine des souches résistantes. Cependant, la détermination des CMI des antifongiques n’est pas réalisable en l’absence de culture positive. Dans ce contexte, ce travail visait à comparer deux trousses de PCR en temps-réel (MycoGENIE® et AsperGenius®) détectant simultanément Aspergillus sp. et les principales mutations associées à la résistance (gène cyp51A), directement dans les prélèvements pulmonaires, par rapport aux techniques utilisées en routine pour détecter A. fumigatus et son profil de résistance (culture, Etest®, PCR « maison »). Au total, 60 LBA de patients immunodéprimés à risque d’AI et 125 expectorations de patients atteints de mucoviscidose ont été inclus. Les souches résistantes ont fait l’objet du séquençage de cyp51A, afin d’identifier les mutations responsables. Ce travail a démontré l’intérêt des outils moléculaires dans le diagnostic d’AI, avec une sensibilité supérieure à celle de la culture (79,3% versus 55,2%). Cependant, la performance des PCR ciblant les marqueurs de résistance est décevante, et la détermination des CMI de souches isolées en culture reste la méthode de référence pour dépister la résistance. A Rennes, l’émergence d’A. fumigatus résistants est réelle chez les patients atteints de mucoviscidose (5/41 souches isolées en culture, 12%), mais aucune souche résistante n’a été détectée chez les patients immunodéprimés. Abstract : Aspergillus fumigatus causes various diseases ranging from invasive aspergillosis (IA) in immunocompromised hosts to chronic pulmonary aspergillosis and fungal allergic diseases, including allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA) when colonization is chronic, as in patients with cystic fibrosis. The diagnosis of IA is challenging due to a lack of sensitive and specific clinical and radiological signs. Triazoles are the mainstay of therapy for aspergillosis, as first-line therapy for IA (voriconazole), or for the prophylaxis (posaconazole). However, over the past decade, the emergence of clinical azole-resistant A. fumigatus strains has been reported in Europe, due to mutations on the cyp51A gene. Current methodology for resistance detection requires a positive culture but the high frequency of negative cultures greatly limits ability to detect it. In this context, we evaluated two commercially available Aspergillus real-time PCR assays (MycoGENIE® and AsperGenius®), that detect clinically relevant Aspergillus species directly from pulmonary samples, and simultaneously identify the most prevalent cyp51A mutations in A. fumigatus. These methods were compared to routinely-used conventional methods (culture, Etest®, in-house PCR assays) to detect A. fumigatus and its resistance pattern. To this end, a total of 60 bronchoalveolar lavage (BAL) fluid specimens collected from high-risk immunocompromised patients and 125 sputum samples from patients with cystic fibrosis were analyzed. For resistant isolates, the cyp51A gene and its promoter were sequenced to detect mutations responsible for resistance. This study demonstrated that molecular detection methods had a sensitivity higher than culture (79,3% versus 55,2%), and were useful in IA diagnosis. However, the performance of resistance detection by commercial PCR was disappointing, thus MIC determination from culture-isolated strains currently remains the gold standard to detect azole resistance. In Rennes, the emergence of resistant A. fumigatus is a reality in patients with cystic fibrosis (5/41 isolates, 12%), but no resistant strain was detected in immunocompromised patients. | |||