Insights into the physicochemical parameters of DNA/Poly(ethylenimine) polyplexes governing stability and promoting an efficient gene delivery into cells (Étude des paramètres physico-chimiques des polyplexes ADN/poly(éthylèneimine) régissant leur stabilité et favorisant une administration efficace des gènes dans les cellules) Montaño González‎, Paulina Alejandra - (2024-12-13) / Université de Rennes Insights into the physicochemical parameters of DNA/Poly(ethylenimine) polyplexes governing stability and promoting an efficient gene delivery into cells Accéder au document :  https://ged.univ-rennes1.fr/nuxeo/site/esupversion...

Langue : Anglais Directeur(s) de thèse:  Gauffre, Fabienne; Bravo Anaya, ‎Lourdes Mónica Discipline : Chimie physique, chimie théorique Laboratoire :  ISCR Ecole Doctorale : S3M Classification : Physique Mots-clés : polyélectrolytes, complexes de polyélectrolytes (PECs), poly(éthylènimine) (PEI), plasmide peGFP-C3, glycosaminoglycanes, interactions électrostatiques, dissociation, trafic intracellulaire, efficacité de transfection Complexes de polyélectrolytes

Résumé : Le manque de compréhension sur la stabilité et les mécanismes de dissociation des polyplexes à base d'acides nucléiques, permettant la libération d'ADN, constitue actuellement une limitation majeure dans la délivrance de gènes à partir de vecteurs non viraux. Bien que de nombreux progrès aient été réalisés dans ce domaine, l'efficacité de ces systèmes synthétiques reste bien inférieure à celle obtenue par les systèmes viraux, avec seulement 0,01 à 2% des acides nucléiques initialement chargés capables d'exercer leur fonction biologique au sein de la cellule. La poly(éthylènimine) (PEI) est l'un des polycations les plus utilisés pour la délivrance de gènes en raison de son efficacité de transfection élevée prouvée, ce qui en fait un modèle intéressant d'agent complexant de l'ADN pour ce travail. Les recherches effectuées et présentées dans cette thèse de doctorat visent à réduire le manque de connaissances sur la stabilité et la dissociation des polyplexes PEI/ADN en présence de milieux biologiques et de biomacromolécules anioniques, ainsi que sur l'impact des propriétés physicochimiques des polyplexes PEI/ADN sur le trafic intracellulaire et l'efficacité de transfection. Pour atteindre ces objectifs, la complexation d'un ADN plasmidique (peGFP-C3) a été réalisée avec quatre échantillons de PEI différents, ayant des masses molaires et des structures différents (ramifiés ou linéaires), et à différents rapports de charge. La stabilité des polyplexes PEI/peGFP-C3 a été étudiée en termes de la taille des particules et de la libération de l'ADN plasmidique dans des environnements ayant différentes forces ioniques, ainsi qu'en présence de macromolécules biologiques telles que les glycosaminoglycanes (GAG). Il a été constaté que la densité de charge élevée de l'héparine par rapport aux autres GAGs et polyanions, ainsi que les fortes interactions entre l'héparine et le PEI, déterminées à partir d'études thermodynamiques, sont les paramètres cruciaux qui déterminent la force de complexation avec le PEI et facilitent ensuite la libération d'ADN des polyplexes. Des mesures de dichroïsme circulaire ont révélé que le plasmide conserve sa conformation de type B après complexation avec le PEI et après libération ultérieure avec l'héparine. De plus, des corrélations entre les données d'expression des protéines rapporteuses transfectées dans des cellules HEK293T3 et les caractéristiques moléculaires du PEI, ainsi que les caractéristiques physicochimiques des polyplexes, ont permis de révéler que la PEI ramifiée avec une masse molaire de 25 kg/mol est celle qui favorise à la fois une internalisation cellulaire et une expression de GFP plus élevées sur les cellules HEK293T. À long terme, les résultats de ce travail permettront de proposer des lignes directrices pour aider à concevoir des vecteurs de gènes non viraux plus efficaces et moins cytotoxiques avec un grand potentiel pour des nouvelles applications thérapeutiques. Abstract : The lack of understanding of the stability and dissociation mechanisms of nucleic acid-based polyplexes, allowing the release of DNA, is currently a major limitation in non-viral gene delivery. Although a great deal of progress has been made in this field, the efficacy of these synthetic systems remains much lower than that achieved by viral systems, with only 0.01 to 2% of initially loaded nucleic acids able to exert their biological function within the cell. Poly(ethylenimine) (PEI) is one of the most widely used polycations for gene delivery due to its proven high transfection efficiency, making it an interesting model of DNA complexing agent for this work. The research performed and stated in this PhD thesis aims to reduce the gap in the knowledge about PEI/DNA polyplexes stability and dissociation in presence of biological media and anionic biomacromolecules, as well as on the impact of PEI/DNA polyplexes physicochemical properties in intracellular trafficking and transfection efficiency. To achieve these goals, the complexation of a plasmid DNA (peGFP-C3) was conducted using four different PEI samples, having different molecular weights and structures (branched or linear), and at different charge ratios. The stability of PEI/peGFP-C3 polyplexes was studied in terms of particle size and plasmid DNA release at different environments of ionic strength, as well as in presence of biological macromolecules such as glycosaminoglycans (GAGs). It was found that heparin’s high charge density, compared to other GAGs and polyanions, as well as strong interactions between heparin and PEI, determined from thermodynamic studies, are the crucial parameters that drive the strength of complexation with PEI and subsequently facilitate the release of DNA from the polyplexes. Circular dichroism measurements revealed that the plasmid maintains its B-type conformation after complexation with PEI and after subsequent release in heparin. Furthermore, correlations between data of the expression of reporter protein transfection assays in HEK293T3 cells with both the molecular characteristics of PEI and the physicochemical characteristics of the polyplexes allowed revealing that the branched PEI with a molecular weight of 25 kg/mol promoted higher both cell internalization and GFP expression on HEK293T cells. In the long term, the outcome of this work will be to propose guidelines to help design more effective, and less cytotoxic non-viral gene carriers with a great potential for new therapeutic applications.