Université de Rennes 1 Identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement sexuel Identification of new genes implicated in sexual development développement sexuelACPAexomeCRISPR-Cas9 sexual developmentarray-CGHexomeCRISPR-Cas9 Développement psychosexuel Filtres à ADN Exome CRISPR-Cas9 Le développement sexuel repose sur un ensemble de voies de signalisation complexes. Toute perturbation de ces voies peut être responsable de variations du développement sexuel (Differences of Sexual development, DSD), isolée ou syndromique. A ce jour, près de la moitié des patients atteints reste sans diagnostic. L’objectif de ce travail a été d’étudier des foetus porteurs de DSD syndromiques par différentes approches de résolution croissante : caryotype, ACPA (Analyse Chromosomique par Puce à ADN), séquençage haut débit de l’exome en trio, afin d’identifier de nouveau(x) gène(s) ou de nouveau(x) variant(s) responsables de DSD. Dans une cohorte de foetus avec DSD syndromique sans dysgonosomie ou aneuploïdie (chromosomes 13, 18 et 21) au caryotype, l’ACPA a permis un taux diagnostique de 12,2%. Les remaniements chromosomiques de grande taille (>5Mb) représentaient l’étiologie principale du DSD et incluaient des gènes connus pour donner des DSD (DMRT1, NR5A1, NSD2 etc.) mais également des gènes candidats (BARX, CHD4, UBE2S…). Chez les patients sans diagnostic après ces explorations, le séquençage de l’exome en trio a permis d’obtenir un taux diagnostique de 40%. Ces études ont également permis de faire émerger un nouveau variant dans un gène récemment décrit : PBX1:c.320G>A. Pour analyser l’impact de ce variant, un modèle cellulaire knocked-down (KD) pour PBX1 a été généré par technique CRISPRCas9. Ces cellules KD et des cellules sauvages ont été transfectées avec un plasmide codant pour PBX1 sauvage ou mutant. La transfection améliorait la prolifération des deux lignées cellulaires. Le RNA-seq montrait un effet modeste de la protéine mutante sur le transcriptome, néanmoins U2AF1, impliqué dans la machinerie d’épissage, représentait un gène-candidat intéressant pour expliquer le phénotype généré par la protéine PBX1 mutante. Au total, caryotype, ACPA, séquençage de l’exome et modèles cellulaires contribuent à améliorer le diagnostic des patients atteints de DSD. Sexual development relies on complex signaling pathways. Any distruption of them can lead to differences of sexual development (DSD), either isolated or syndromic. To date, the etiology of DSD remains unknown in almost half of the patients. This work aimed at studying fetuses with syndromic DSD through different approaches of growing resolution: karyotype, array-CGH (aCGH), trio whole exome sequencing (WES), in order to identify new genes or new variants responsible from DSD. In a cohort of fetuses presenting with syndromic DSD without aneuploidy (for gonosomes or chromosomes 13, 18 or 21) at standard karyotype, aCGH reached a diagnostic rate of 12.2%. Large chromosomal imbalances (>5Mb) were the most frequent and contained either known DSD genes (DMRT1, NR5A1, NSD2 etc.) but also interesting candidate genes (BARX, CHD4, UBE2S…). In fetuses with normal aCGH, trio WES reached a diagnostic rate of 40%. These studies also helped to find a new variant in a recently described gene: PBX1:c.320G>A. To analyze the impact of this variant, a cellular model knowked-down (KD) for PBX1 was generated through CRISPR-Cas9 technology. These KD cells and wildtype (WT) cells were transfected using plasmids coding for either WT PBX1 or mutant PBX1 protein. Transfection improved cell proliferation for both cell lines. RNAseq analyses showed only a modest effect of the mutant protein on transcriptome. However, U2AF1, a gene coding for a protein of the splicing machinery, represented an interesting candidate to explain the phenotype of the patient. To conclude, karyotype, aCGH, WES and cellular models helped to enhance diagnosis success for DSD patients. Electronic Thesis or DissertationText fren application/pdf1 : 21386 Kohttps://ged.univ-rennes1.fr/nuxeo/site/esupversions/e9df7d8d-1e0b-4d50-9364-3bf8ac4c80c3 Mary Laura 1990-11-15 FR 232699526 laura.mary@chu-rennes.fr 2022REN1B063 http://www.theses.fr/2022REN1B063 2022-12-08 Génétique, génomique et bioinformatique Universite de Rennes 1thesis.degree.grantor_1 02778715X Doctorat non ouiBelaud-RotureauMarc-Antoineintervenant_1092289177JaillardSylvieintervenant_2126617376Dejucq-RainsfordNathalieintervenant_3165288973FauquePatriciaintervenant_6077502485CouttonCharlesintervenant_7137277547Schluth-BolardCarolineintervenant_4099490145PellestorFranckintervenant_5034085009 Biologie-SantéecoleDoctorale_1 221707778 IRSET partenaireRecherche_1 177984775 ddc:610 Belaud-RotureauMarc-AntoineJaillardSylvieDejucq-RainsfordNathalieSchluth-BolardCarolinePellestorFranckFauquePatriciaCouttonCharlesUniversite de Rennes 1Sciences et technologie, medecine, pharmacie, odontologie, droit, economie, gestion, philosophieBiologie-SantéÉcole doctorale Biologie-Santé (Rennes) IRSET ASCII PDF 21899561