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| Mise au point d'un modèle de culture d'hépatocytes humains primaires en 3 dimensions pour l'étude du virus de l'hépatite B (Optimizing a 3-dimensional primary human hepatocyte culture model to support hepatitis B virus infection) Besombes, Juliette - (2021-09-30) / Universite de Rennes 1 - Mise au point d'un modèle de culture d'hépatocytes humains primaires en 3 dimensions pour l'étude du virus de l'hépatite B
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Langue : Français Directeur(s) de thèse: Thibault, Vincent Discipline : Pharmacie Classification : Médecine et santé Mots-clés : VHB, culture cellulaire, 3D, hépatocytes, infection, modèle in vitro
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Résumé : Le VHB constitue un problème de santé publique mondial avec environ 257 millions de personnes infectées chroniquement. Malgré une vaccination efficace, il reste responsable d’une importante morbi-mortalité. Sa spécificité d’hôte rend difficile les études in vivo et son hépatotropisme complique la mise au point de modèle in vitro imitant l’architecture complexe du foie. La difficulté de cultiver des hépatocytes humains primaires (HHP) qui se maintiennent différenciés sur le long terme pose des limites importantes pour l'étude du VHB. Des modèles de culture d’HHP en 3D ont été développés récemment et offrent un microenvironnement plus proche des conditions in vivo. Nous décrivons ici la caractérisation d’un modèle de culture cellulaire en 3D basé sur la formation de sphéroïdes d’HHP permissifs pour l’infection par le VHB. La susceptibilité à l’infection a été suivie grâce aux dosages de l’AgHBe dans les surnageant de culture, reflet de la présence d’ADN super enroulé dans les cellules. Une infection optimale est obtenue après une incubation des HHP en présence d’un inoculum concentré 50 fois, obtenu à partir de surnageants de culture de cellules HepG.2.2.15. Dans ce modèle, les HHP peuvent être maintenus en culture jusqu’à 38 jours après l’infection et des infections avec une faible quantité d’inoculum viral sont possibles bien que la sécrétion d’AgHBe soit faible. La composition du milieu cellulaire a été ajustée afin d’optimiser l’infection. Le Myrcludex B et l’héparine à forte concentration (133µg/mL) bloquent l’infection. Alors que, étonnamment, l’héparine à concentration physiologique (4µg/mL) dans le milieu de culture la favorise. Des infections avec des plasmas de patients infectés par le VHB sont également envisageables. Des études supplémentaires restent nécessaires pour valider ce modèle. Abstract : HBV is a major health problem with nearly 257 million people chronically infected. Despite effective vaccination, it remains responsible for significant morbidity and mortality. Host specificity makes difficult in vivo studies and hepatotropism complicates the development of in vitro models that mimic the complexity of the liver. It is hard to keep differentiated the primary human hepatocytes (PHH) in culture and that cause important limitations for the study of HBV and host/pathogen interactions. Recently, 3D culture models of HHP have been developed and offer a microenvironment closer to in vivo conditions. We describe the characterization of a 3D cell culture model based on the formation of HHP spheroids which support the HBV infection. Optimal infection is obtained after incubation of HHP with of a 50-fold concentrated and derived from HepG.2.2.15 cell culture supernatant. Susceptibility to infection was monitored by production of HBeAg, reflecting the presence of covalently closed circular DNA in cells. Long-term HBV infections are possible as well as infections with a low amount of viral inoculum even though HBeAg secretion is low. Myrcludex B and high concentration of heparin block infection. Surprisingly, heparin at physiological concentration in the culture medium promotes infection. Infections with plasmas from HBV-infected patients are also possible. Further studies are needed to validate this model. | |||