| Etude fonctionnelle d'un ARN régulateur exprimé par le Staphylocoque doré, impliqué dans la virulence et la phagocytose des bactéries par les macrophages humains (Fonctionnal study of a regulatory RNA expressed by the gold staphylococcus, involved in bacterial virulence and phagocytosis by human macrophages) Raynaud, Simon - (2016-10-05) / Universite de Rennes 1 - Etude fonctionnelle d'un ARN régulateur exprimé par le Staphylocoque doré, impliqué dans la virulence et la phagocytose des bactéries par les macrophages humains
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Langue : Français Directeur(s) de thèse: Le Pabic, Hélène Discipline : Pharmacie Classification : Médecine et santé Mots-clés : S. aureus , SprC , partenaires protéiques et ARN , chromatographie d’affinité , virulence
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Résumé : Staphylococcus aureus est une bactérie commensale de la peau capable de rapidement développer ou acquérir de multiples résistances aux antibiotiques. Elle est responsable de 16% des infections nosocomiales ce qui en fait un problème majeur de santé publique dans le monde. Sa virulence est multifactorielle et fait intervenir des protéines et des ARN régulateurs. L’un d’entre eux, l’ARN SprC, diminue la virulence et l’internalisation de S. aureus par les monocytes et les macrophages humains (Le Pabic et al., 2015). Le Pabic et al. ont montré que SprC interférait avec la phagocytose de S. aureus en partie par son contrôle de l’expression de l’Autolysine (Atl), une protéine impliquée dans l’internalisation de S. aureus. En effet, SprC régule négativement la production de l’Atl en bloquant la traduction de son ARNm par inhibition directe. Cependant, cette interaction entre SprC et l’ARNm de l’atl est faible (Kd = 35µM) suggérant l’intervention de partenaires supplémentaires dans cette interaction. Afin d’identifier de nouveaux partenaires protéiques et ARN de SprC, une technique de chromatographie d’affinité a été mise au point. Elle met en jeu l’ARN SprC fusionné à un tag MS2 lui permettant de se fixer à une résine d’amylose par l’intermédiaire de protéines MPB-MS2. La méthode a été validée par qPCR en utilisant un contrôle interne, l’ARNm rot connu pour se fixer à l’ARNIII. Enfin, après l’isolement des ARN se fixant à SprC, ces derniers ont été séquencés par RNAseq et les reads ont été alignés sur un génome de référence. L’analyse des niveaux d’expression du RNAseq a permis d’identifier 4 ARN candidats se fixant à SprC. L’analyse protéomique des partenaires de SprC a également permis l’identification la protéine ribosomale S2 se fixant fortement à SprC, et dont la validation de l’intercation est en cours. Le rôle de ces partenaires dans la virulence de S. aureus sera étudié dans le but de développer de nouvelles thérapies anti-staphylococciques. Abstract : Staphylococcus aureus is a commensal bacterium of the skin able to quickly develop or acquire multiple resistances to antibiotics. It is responsible for 16% of nosocomial infections that make it a major public health issue worldwide. Its virulence is multifactoral and involves proteins and regulatory RNAs. One of them, the SprC RNA, decreases virulence and S. aureus internalisation by human monocytes and macrophages (Le Pabic et al., 2015). Le Pabic and al., showed that SprC interferes with S. aureus phagocytosis in part by monitoring expression of the Autolysin (Atl), a protein involved in S. aureus internalisation. The author demonstrated that SprC negatively regulates Atl production by blocking translation of its mRNA through direct inhibition. However, interaction between SprC and the atl mRNA is weak (Kd = 35µm), which suggested the involvement of additional partners. In order to identify new proteins and RNA partners of SprC, an affinity chromatography technique has been developed. It involves the SprC RNA combined to a MS2 tag allowing it to bind to an amylose resine through a MBP-MS2 protein. The method has been validated by qPCR using an internal control, rot mRNA that is known to bind RNAIII. Then, following the isolation of RNA bound to SprC, the latter were sequenced by RNAseq and reads aligned on to a reference genome. Analysis of RNAseq expression level led to the identification of 4 RNA candidates bound to SprC. Proteomic analyses of SprC partners also allowed the identification of ribosomal protein S2 which strongly which strongly bind to SprC, and whose interaction validation is in progress. The functions of these partners in S. aureus virulence will be subsequently study in order to develop new anti-staphylococcal therapies. | |||