| Découverte de nouvelles protéines impliquées dans la spermatogenèse chez le rat (Discovery of novel proteins involved in spermatogenesis in the rat) Chocu, Sophie - (2014-09-30) / Universite de Rennes 1 - Découverte de nouvelles protéines impliquées dans la spermatogenèse chez le rat
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Langue : Français Directeur(s) de thèse: Pineau, Charles Discipline : Biologie Laboratoire : IRSET Ecole Doctorale : Sciences de la matière Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie Mots-clés : spermatogenèse, cellules germinales, protéomique, protéome, transcriptomique, approche omique intégrative, profilage des ARNs, quantification relative des protéines
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Résumé : La spermatogenèse chez les mammifères est une fonction biologique complexe incluant des processus de prolifération cellulaire, de méiose et de différenciation uniques visant à la production des gamètes mâles au sein du testicule. Si l'épithélium séminifère, théâtre de ce processus est bien décrit sur le plan de son organisation et de la morphologie des cellules qui le composent, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la spermatogenèse ne sont pas encore complètement décryptés. Ces processus par lesquels les cellules germinales diploïdes indifférenciées, les spermatogonies, entrent en méiose pour donner ensuite des cellules haploïdes qui subissent de nombreuses transformations morphologiques incluant la compaction du génome, la formation de l'acrosome et du flagelle sont largement supportés par les cellules de Sertoli, cellules nourricières, qui sont en étroite interaction mécanique et fonctionnelle avec les cellules germinales. Dans ce contexte, les cellules germinales et les cellules de Sertoli entretiennent le dialogue nécessaire au bon déroulement de la spermatogenèse et de la spermiogénèse, et duquel dépend la production de 100 millions de spermatozoïdes par jour chez le rat. La spermatogenèse repose sur l'expression coordonnée et séquentielle des gènes, dont les produits spécifiques de chaque stade de développement des cellules germinales sont essentiels à chaque étape clé et à son bon déroulement. La transcriptomique depuis les années 1990, et la protéomique depuis les années 2000 ont contribué à l'amélioration de la connaissance de ces mécanismes. Deux études importantes ont été menées dans notre unité, et qui ont été à la base de mes travaux de thèse. D'une part une étude de protéomique sur le long terme visant à caractériser par des approches systématiques et différentielles le protéome testiculaire avec un focus sur celui de la lignée germinale. D'autre part, une étude très récente qui a permis de caractériser et quantifier le transcriptome des cellules testiculaires isolées de rat, avec une haute résolution, en utilisant une approche de séquençage de novo des transcrits (RNA-seq). Cette dernière étude a mis en évidence l'accumulation de longs ARNs non codants (lncRNAs), et de transcrits testiculaires non annotés (TUTs) aux stades méiotique et post-méiotique de la spermatogenèse, chez le rat. Dans ce contexte, mon travail de thèse a consisté à valider le potentiel codant de nombreux gènes exprimés dans les cellules germinales, par une approche dite PIT (Proteomics Informed by Transcriptomics) couplant protéomique Shotgun et RNA-seq. Dans ce type d'approche, les séquences protéiques déduites des transcrits des différents types cellulaires du testicule assemblés par RNA-seq sont intégrées dans une base personnalisée de séquences protéiques utilisée pour interroger les données de spectrométrie de masse obtenues à partir d'extraits de protéines totales de cellules méiotiques et post-méiotiques. Mon travail a consisté d'autre part à identifier des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels susceptibles d'intervenir dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales, par une approche de quantification relative ICPL. Par ailleurs, j'ai pu établir par protéomique Shotgun un premier protéome des cellules de Sertoli, des cellules germinales et des corps résiduels de rat. Les peptides identifiés par MS/MS sur l'ensemble de ces types cellulaires sont visuellement accessibles sur le ReproGenomicsViewer (http://rgv.genouest.org/). L'approche PIT a permis de montrer que 69 TUTs ou lncRNA (correspondant à 44 loci) codent pour des protéines dans les cellules méiotiques et post méiotiques chez le rat, et de confirmer expérimentalement l'expression post-méiotique de deux nouveaux transcrits, codant pour la protéine VAMP9, une protéine de la famille SNARE, et pour une nouvelle énolase T-ENOL. L'expression post-méiotique de la nouvelle protéine T-ENOL a été confirmée par immunohistochimie à l'aide d'un anticorps polyclonal produit contre la protéine recombinante. Cette approche nous a également permis d'identifier de nouvelles isoformes de protéines connues, spécifiques de chaque stade de la spermatogenèse. L'analyse différentielle par ICPL des protéines membranaires des cellules germinales et des corps résiduels nous a permis d'établir une liste de 166 protéines dont l'expression est différentielle entre les spermatocytes pachytène, les spermatides rondes et les corps résiduels. Du fait de cette expression différentielle, ces protéines sont susceptibles de jouer un rôle dans la spermiogénèse. Grâce aux annotations de le Gene Ontology, j'ai pu établir une liste de 8 protéines ayant un rôle supposé dans la transduction du signal, la reconnaissance cellulaire ou bien la différenciation, donc potentiellement impliquées dans le dialogue entre les cellules de Sertoli et les cellules germinales. Cette étude a montré par ailleurs la surexpression dans les cellules germinales, de quelques protéines de la famille des Rab et de la famille des TMED récemment reconnues comme ayant un rôle de régulation dans l'immunité innée. Abstract : Spermatogenesis in mammals is a complex biological function including cellular processes such as proliferation, meiosis and differentiation aiming to the production of male gametes in the testis. If the theatre of this process, the seminiferous epithelium, is well described in terms of organization and cellular morphology of cells that compose it, the molecular mechanisms underlying spermatogenesis are not yet fully decrypted. These processes by which diploid undifferentiated germ cells, spermatogonia, enter meiosis to give haploid cells that undergo many morphological changes including compaction of the genome, formation of the acrosome and flagellum are largely borne by the Sertoli nurse cells, which are in close mechanical and functional interaction with germ cells. In this context, germ cells and Sertoli cells maintain a dialogue necessary to the success of spermatogenesis and spermiogenesis, on which relies the production of 100 million sperm per day in rats. Spermatogenesis is based on the coordinated and sequential expression of genes, including specific products for each stage of germ cell development. These gene products are essential at each key stage of spermatogenesis and its smooth running. Transcriptomics since the 1990s, and proteomics since the 2000s have contributed to the improved understanding of these mechanisms. Two major studies have been conducted in our unit and have been the basis of my thesis work. First, a long term proteomic study aiming at characterizing the testicular proteome with a focus on the germ line, and the other one, a very recent study that characterized and quantified the transcriptome of isolated rat testicular cells at high resolution using a de novo sequencing of transcripts (RNA-seq) approach. The latter study showed the accumulation of long non-coding RNAs (lncRNAs) and testicular unannotated transcripts (TUTs) at meiotic and post-meiotic stages of spermatogenesis in the rat. In this context, my thesis work aimed at validating the coding potential of many genes expressed in germ cells using RNA-seq combined with shotgun proteomics, a so-called PIT (Proteomics Informed by transcriptomics) approach. In this approach, the protein sequences translated from the transcripts assembled by RNA-seq in the different testicular cell types are integrated into a custom database of protein sequences used to query mass spectrometry data obtained from protein extracts from meiotic and post-meiotic cells. On the other hand, my work aimed at identifying membrane proteins in germ cells and residual bodies that may be involved in the dialogue between Sertoli cells and germ cells using a ICPL relative quantification approach. In addition, I was able to provide the first proteome of rat Sertoli cells, germ cells and residual bodies by shotgun proteomics. The peptides identified by MS/MS in all these cell types are visually available on the ReproGenomicsViewer (http://rgv.genouest.org/). The PIT approach showed that 69 TUTs or lncRNA (corresponding to 44 loci) code for proteins in meiotic cells and post meiotic cells, and we confirmed experimentally the meiotic and post-meiotic expression for two new transcripts encoding for VAMP9, a protein of the SNARE family, and a new testicular enolase T-ENOL. The post-meiotic expression of T-ENOL protein was confirmed by immunohistochemistry using a polyclonal antibody raised against the recombinant protein. This approach also allowed us to identify new isoforms of known proteins, specific to each stage of spermatogenesis. Differential analysis of membrane proteins of germ cells and residual bodies by ICPL enabled us to establish a list of 166 proteins whose expression is differential between pachytene spermatocytes, round spermatids and residual bodies. Their differential expression suggests that these proteins may play a role in spermiogenesis. Thanks to the Gene Ontology annotations, a list of eight proteins with a putative role in signal transduction, cell recognition or differentiation, thus potentially involved in the dialogue between Sertoli and germ cells was drawn. This study also showed the overexpression in germ cells of some Rab family proteins and TMED family proteins recently recognized as having a regulatory role of innate immunity. | |||