| Development and characterization of microscopy-based approaches to monitor autophagy and mitochondrial functions in living cells (Développement et caractérisation d'approches basées sur la microscopie pour surveiller le processus d'autophagie et les fonctions mitochondriales au sein des cellules vivantes) Gökerküçük, Elif Begüm - (2022-09-28) / Universite de Rennes 1 Development and characterization of microscopy-based approaches to monitor autophagy and mitochondrial functions in living cells
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Langue : Anglais Directeur(s) de thèse: Tramier, Marc; Bertolin, Giulia Discipline : Biologie cellulaire, biologie du développement Laboratoire : IGDR Ecole Doctorale : Biologie-Santé Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie Mots-clés : autophagie, LC3, ATG4, mitochondrie, FRET-FLIM, biocapteur
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Résumé : Bien que plusieurs mécanismes de l'autophagie aient été caractérisés au cours de la dernière décennie, suivre cette voie en temps réel est un véritable défi. Parmi les événements précoces conduisant à l'activation de l'autophagie, la protéase ATG4B amorce le protagoniste clé de l'autophagie, LC3B. En regard du manque de reporters pour suivre cet événement dans les cellules vivantes, nous avons développé un biocapteur basé sur la technologie Förster’s Resonance Energy Transfer (FRET), répondant à l'amorçage de LC3B par ATG4B. Le biocapteur a été généré en encadrant LC3B dans une paire de fluorophores FRET donneur-accepteur résistant au pH que sont Aquamarine et tdLanYFP. La majeure partie de mon travail de thèse fut consacrée à caractériser ce biocapteur en utilisant un microscope développé dans notre équipe appelé fastFLIM (fast Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Nous avons montré ici que le biocapteur a une double application. Premièrement, le phénomène de FRET indique l'amorçage de LC3B par ATG4B et la résolution de l'image FRET permet de caractériser la répartition spatiale de l'activité d'amorçage. Secondairement, la quantification du nombre de foyers Aquamarine-LC3B détermine le degré d'activation de l'autophagie au sein des cellules vivantes. Nous avons ensuite montré grâce à la régulation négative d'ATG4B (par technologie siRNA), qu'il existe de légers pools de LC3B non amorcés, et que l'amorçage du biocapteur est complètement aboli dans les cellules dont la présence d’ATG4B est totalement abrogée (par technologie CRISPR). Enfin, nous avons criblé les inhibiteurs d'ATG4B disponibles dans le commerce et nous avons illustré leur différent mode d'action en mettant en œuvre une méthode d'analyse à résolution spatiale et haute sensibilité, en combinant la technologie de FRET et la quantification des foyers autophagiques. Ainsi, le biocapteur LC3B FRET ouvre la voie à un suivi hautement quantitatif de l'activité ATG4B dans les cellules vivantes et en temps réel, avec une résolution spatio-temporelle sans précédent. Parallèlement à cette partie de mes études de thèse, j'ai étudié certaines des altérations mitochondriales retrouvées cellules cancéreuses de mélanome sensibles et résistantes à la chimiothérapie. En effet, j’ai analysé la dynamique mitochondriale ainsi que les niveaux de protéines mitochondriales dites OXPHOS dans les cellules de mélanome résistantes ou non en utilisant un test de microscopie de photoconversion et des tests biochimiques. Les découvertes et observations préliminaires résultant de cette étude ont jeté les bases du projet plus vaste de notre équipe consistant à utiliser des biocapteurs multiplex, y compris le biocapteur LC3B, pour suivre l'autophagie/mitophagie et diverses fonctions mitochondriales simultanément dans les cellules cancéreuses du mélanome. Abstract : Although several mechanisms of autophagy have been dissected in the last decade, following this pathway in real time remains challenging. Among the early events leading to autophagy activation, the ATG4B protease primes the key autophagy player LC3B. Given the lack of reporters to follow this event in living cells, we developed a Förster’s Resonans Energy Transfer (FRET) biosensor responding to the priming of LC3B by ATG4B. The biosensor was generated by flanking LC3B within a pH-resistant donor-acceptor FRET pair, Aquamarine/tdLanYFP. My main thesis work was dedicated to characterize this biosensor by using a microscope developed in our team called fastFLIM (fast Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). We here showed that the biosensor has a dual readout. First, FRET indicates the priming of LC3B by ATG4B and the resolution of the FRET image allows to characterize the spatial heterogeneity of the priming activity. Second, quantifying the number of Aquamarine-LC3B puncta determines the degree of autophagy activation. We then showed that there are small pools of unprimed LC3B upon ATG4B downregulation, and that the priming of the biosensor is completely abolished in ATG4B knockout cells. Last we screened for commercially-available ATG4B inhibitors, and we illustrated their differential mode of action by implementing a spatially-resolved, broad-to- sensitive analysis pipeline combining FRET and the quantification of autophagic puncta. Therefore, the LC3B FRET biosensor paves the way for a highly-quantitative monitoring of the ATG4B activity in living cells and in real time, with unprecedented spatiotemporal resolution. In the second part of my thesis studies, I investigated the alterations in the mitochondrial dynamics and mitochondrial OXPHOS protein levels in chemotherapy sensitive and resistant melanoma cancer cells by using a microscopy assay of photoconversion and biochemical assays. Preliminary findings and observations resulting from this study have laid the groundwork of our team’s greater project of using multiplex biosensors including the LC3B biosensor to follow autophagy/mitophagy and several mitochondrial functions simultaneously in melanoma cancer cells. | |||