| Typage des souches de Clostridium botulinum du groupe III : développement d'outils et application à l'épidémiologie du botulisme animal (Clostridium botulinum group III typing : Development of tools and application to the epidemiology of animal botulism) Le Gratiet, Thibault - (2022-05-24) / Universite de Rennes 1 - Typage des souches de Clostridium botulinum du groupe III : développement d'outils et application à l'épidémiologie du botulisme animal
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Langue : Français Directeur(s) de thèse: Chemaly, Marianne; Le Maréchal, Caroline Discipline : Microbiologie, virologie, parasitologie Laboratoire : ANSES - Ploufragan Ecole Doctorale : EGAAL Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie Mots-clés : Clostridium botulinum, botulisme animal, outils de typage, WGS, CRISPR-Cas, MLVA
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Résumé : Le botulisme animal, qui touche principalement les volailles, l’avifaune sauvage et les bovins, se manifeste par une paralysie flasque causée par l’action des neurotoxines botuliques. Les toxines les plus fréquemment associées aux épisodes de botulisme animal sont celles de type C, D, C/D et D/C, produites par Clostridium botulinum du groupe III, une bactérie anaérobie stricte sporulante, regroupée avec les espèces Clostridium novyi et Clostridium haemolyticum, sous le terme Clostridium novyi sensu lato. L’épidémiologie du botulisme animal est encore méconnue et les données d’épidémiologie moléculaire relatives aux souches impliquées dans le botulisme animal sont quasi inexistantes. Ceci s’explique principalement par l’absence d’outils de typage pour caractériser les souches du groupe C. novyi sensu lato, liée aux difficultés pour isoler les souches de ce groupe. L’objectif de la thèse est de développer des outils de typage adaptés à ce contexte particulier pour permettre de mener des investigations épidémiologiques lors d’épisodes de botulisme animal et pouvoir à terme tracer les souches. Dans un premier temps, une méthode d’isolement a été développée et validée sur des souches impliquées dans des épisodes de botulisme animal en France. Cette méthode a permis d’isoler 35 souches associées à des épisodes de botulisme aviaire. Puis un outil de typage MLVA (Multi Loci Variable number of tandem repeats analysis) a été évalué sur la collection de souches isolées puis appliqué en conditions réelles dans le cadre d’investigations menées dans deux épisodes de botulisme animal. Une autre piste de typage a ensuite été explorée via l’étude des systèmes CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR associated protein). Les résultats ont révélé une prévalence de ces systèmes chez 95 % des souches de C. novyi sensu lato, avec une grande diversité (6 types de système CRISPR-Cas). Cette grande diversité n’a pas permis de proposer un outil de typage basé sur les CRISPR-Cas. Enfin, après une première étape d’optimisation des différentes étapes en amont du séquençage , les génomes de C. novyi sensu lato ont été comparés afin d’identifier de nouvelles cibles pertinentes. Ces travaux ont permis de développer une approche permettant de séquencer les souches impliquées dans le botulisme aviaire (depuis l’isolement jusqu’au séquençage de l’isolat) et de mettre en place une méthode MLVA qui se révèle particulièrement adaptée au contexte du botulisme aviaire. Ils ont également permis d’identifier de nouvelles cibles très prometteuses qui permettront de proposer d’autres outils de typage dans le futur, applicables au botulisme animal de manière général. Abstract : Animal botulism, which affects mainly poultry, wildbirds and cattle, is a neuroparalytic disease caused by the action of botulinum neurotoxins type C, D, C/D and D/C. They are produced by Clostridium botulinum group III, an anaerobic, spore-forming bacteria belonging to the genospecies Clostridium novyi sensu lato alongside Clostridium novyi and Clostridium haemolyticum. The epidemiology of animal botulism is still poorly understood and molecular typing data are missing. This is mainly due to the unavailibity of typing tools for C. novyi sensu lato characterization, mostly because strain isolation is very difficult. The objective of the PhD project is to develop typing tools adapted to this specific context to be able to perform epidemiological investigations during animal botulism outbreaks and strain tracking in the future. First, an isolation method was developed and validated using strains involved in animal botulism outbreaks in France. This method allowed the isolation of 35 strains from avian botulism outbreaks. Then, a MLVA (Multi Loci Variable number of tandem repeats analysis) typing tool was evaluated on the isolated strains and used in real conditions during the investigation of two animal botulism outbreaks. Another potentiel typing approach was then explored through the study of CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – CRISPR associated protein) systems. The results revealed the presence of these systems in 95 % of C. novyi sensu lato genomes, with a great diversity (6 different types of CRISPR-Cas system). This high diversity prevents the development of a typing tool based on these CRISPR-Cas systems. Finally, following the optimization of the different steps preceding sequencing, C. novyi sensu lato genomes were compared to identify new relevant targets. This work allowed the development of an approach to sequence strains involved in avian botulism (from strain isolation to whole genome sequencing) and to set up an MLVA method that is particularly adapted to the study of avian botulism. It has also allowed the identification of new targets that are very promising for the development of new tools in the future, usable to investigate all animal botulism outbreaks. | |||