| A yeast-based assay to screen protein-protein interaction modulators (Développement d’une méthode pour cribler des modulateurs d’interaction protéine-protéine chez la levure S. cerevisiae) Sudevan, Aswani - (2021-07-05) / Universite de Rennes 1 A yeast-based assay to screen protein-protein interaction modulators
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Langue : Anglais Directeur(s) de thèse: Rabut, Gwenaël Discipline : Biologie moléculaire et structurale, biochimie Laboratoire : IGDR Ecole Doctorale : Biologie-Santé Classification : Sciences de la vie, biologie, biochimie Mots-clés : criblage, interactions protéine-protéine, luminescence, NanoBiT, levure
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Résumé : Les interactions protéine-protéine (IPP) sont essentielles pour tous les processus physiologiques de la cellule. En raison de leur importance dans la signalisation et la régulation des fonctions cellulaires, une perturbation des IPPs peut entrainer des maladies comme le cancer ou des maladies neurodégénératives. Même si les IPPs sont généralement difficile à cibler, les progrès récents dans le domaine ont permis d’en faire cibles potentielles de médicaments. Mon projet de thèse vise à développer une plateforme de criblage chez la levure Saccharomyces cerevisiae pour faciliter l’étude et l’identification de modulateurs chimiques d’IPPs. Pour cela, nous avons utilisé un test de complémentation protéique appelé NanoLuc Binary Technology qui permet de sonder les IPP avec un grand niveau de sensibilité. La levure est un excellent organisme modèle pour le criblage à grande échelle compte tenu de la facilité de manipulation génétique et de son faible coût de production et de maintenance. Nous avons validé une cassette d’expression permettant de produire des paires de protéines humaines dans des cellules de levure à un niveau contrôlé. Ceci nous a permis de détecter des IPPs dans une grande gamme d’affinité et aussi de mesurer l'inhibition spécifique d’IPPs par des molécules chimiques. D’autre part, les conditions de criblage ont été optimisées pour obtenir une excellente reproductibilité intra- et inter-plaque (Z’ supérieur à 0,7). Des cribles pilotes ont été réalisés à l'aide de librairies de molécules chimiques et 3 paires de protéines - p53/MDM2, Ras/RafRBD et IFT46/IFT52 – afin d’évaluer la fiabilité et le comportement de cette plateforme en mode criblage. Un crible virtuel a également été réalisé en utilisant une base de données composée de millions de composés chimiques afin de rechercher des inhibiteurs potentiels des paires Ras/RafRBD et IFT46/IFT52. Bien qu’aucune des molécules identifiées par ces méthodes ne se soit avérée suffisamment spécifique pour envisager de poursuivre leur développement, ces travaux nous ont permis de valider l’efficacité de la plateforme que nous avons mis au point pour l’étude et la recherche de modulateurs d’IPPs. Abstract : Protein-protein interactions (PPIs) are essential for all the physiological processes in the cell. Due to their importance in signalling and regulatory processes, their misregulation can lead to diseases such as cancer or neurodegenerative disorders. Even though PPIs are often difficult to modulate with chemical compounds, they have emerged as potential drug targets. My PhD project aims at developing a screening platform in the yeast Saccharomyces cerevisiae to facilitate the identification and investigation of chemical PPI modulators. For this purpose, I took advantage of a protein complementation assay called NanoLuc Binary Technology, which enables to probe PPIs with high sensitivity. Yeast is an excellent model organism for large scale screening considering the ease of genetic manipulation and low cost of production and maintenance. We have validated an expression cassette that enables to produce human protein pairs of interest at a controlled level in yeast cells. This enabled to probe PPIs in a wide range of affinities and also to detect the specific inhibition of PPIs using chemical modulators. Moreover, the screening conditions were optimised to achieve an excellent intra- and inter-plate reproducibility in screening conditions (Z’ above 0.7). Pilot screens were performed using chemical compound libraries against three protein pairs - p53/MDM2, Ras/RafRBD and IFT46/IFT52 - to assess the reliability and behaviour of the platform in screening mode. A virtual screen was also performed to search for potential inhibitors of Ras/RafRBD and IFT46/IFT52 using a database consisting of millions of compounds. The best hits were tested in the platform. Although none of the compounds identified with these two strategies were sufficiently selective to envisage developing them further, this work enabled us to validate the yeast-based platform as an efficient method to investigate and screen PPI modulators. | |||