| Optimisation de la prolifération et de la différenciation des hépatocytes humains dans un nouveau modèle de culture 3D: application à l'étude des Amines Hétérocycliques Aromatiques (AHAs) (Optimization of the proliferation and differentiation of human hepatocytes in a new 3D culture model: application to the study of Heterocyclic Aromatic Amines (HAAs)) Rose, Sophie - (2018-07-18) / Universite de Rennes 1 - Optimisation de la prolifération et de la différenciation des hépatocytes humains dans un nouveau modèle de culture 3D: application à l'étude des Amines Hétérocycliques Aromatiques (AHAs)
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Langue : Français, Anglais Directeur(s) de thèse: Langouet, Sophie Discipline : Toxicologie Laboratoire : IRSET Ecole Doctorale : Biologie-Santé Classification : Médecine et santé Mots-clés : Hépatocytes humains primaires et transformés, modèle de culture 3D, prolifération, différenciation, adduits à l’ADN, génotoxicité
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Résumé : Le foie joue un rôle prépondérant dans la biotransformation et l’élimination des xénobiotiques. Le développement de modèles cellulaires hépatiques humains pertinents représente un enjeu majeur afin d’étudier in vitro chez l’Homme la bioactivation de contaminants préoccupants, les altérations à l’ADN qui en dérivent et leur pouvoir mutagène/cancérigène. Ces analyses constituent des étapes clés pour l’identification de biomarqueurs d’exposition indispensables à l’évaluation du risque au niveau des individus et dans les populations. Lors de cette thèse, nous avons mis au point un modèle original de culture 3D en gels de collagène dans lequel les hépatocytes humains s’organisent en sphéroïdes polarisés. Par cette approche, nous avons démontré, pour la première fois, la capacité des hépatocytes primaires cultivés en 3D à proliférer in vitro. De plus, une réinitialisation du cycle cellulaire peut être obtenue après l’inhibition transitoire de la voie de signalisation des MAPKs MEK1/2-ERK1/2. Dans nos conditions, les hépatocytes primaires et transformés expriment des fonctions hépatiques hautement différenciées pendant plusieurs semaines de culture, et les cellules HepaRG se différencient après seulement quelques jours de culture, sans ajout de DMSO. Dans ce contexte, nous avons étudié la génotoxicité d’une classe de contaminants de l’environnement et de l’alimentation, les Amines Hétérocycliques Aromatiques (AHAs). Nos résultats démontrent la pertinence de la culture cellulaire en gels de collagène pour l’identification et la quantification des adduits à l’ADN et les études de toxicité aiguë et chronique dans les hépatocytes humains. Ces travaux représentent une avancée majeure car ils lèvent un verrou au développement de nombreuses applications biotechnologiques. L’établissement de tels modèles d’hépatocytes humains proliférants in vitro permet d’évaluer le pouvoir mutagène des contaminants de l’environnement. Abstract : The liver plays a major role in metabolism and elimination of xenobiotics. The development of relevant human in vitro models represents a major challenge to study the hepatic bioactivation of drugs and contaminants, the DNA alterations and their mutagenic/carcinogenic potential. These analyzes are key steps for identifying biomarkers of exposure that are essential for assessing risk in populations. In this study, we developed an original cellular model of 3D culture in collagen gels in which human hepatocytes are well organized in spheroids with an apico-basal polarity. By this approach, we demonstrated, for the first time, the ability of these 3D primary human hepatocytes to proliferate in vitro. Furthermore, a new cell cycle can be reinitiate after transient MAPKs MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway inhibition. Under our conditions, primary and transformed hepatocytes express highly differentiated hepatic functions for several weeks of culture, and HepaRG cells differentiate after only few days of culture without addition of DMSO. In this context, we investigated the genotoxicity of a class of environmental and food contaminants, the Heterocyclic Aromatic Amines (HAA). Our results demonstrate the relevance of the collagen gel culture for the identification and quantification of DNA adducts and for acute and chronic toxicity studies in human hepatocytes. This work provides long-awaited keys for further biotechnological promising developments. Such establishment of in vitro proliferating human hepatocytes models will enable the evaluation of the mutagenic potential of environmental contaminants. | |||